Farmaceutische Analyse
Voor elke deelvraag zijn 5 punten te behalen op het totaal van 100.
Vraag 1
In een fabriek wordt een cotrimoxazole suspensie geproduceerd (samenstelling zie bijlage). Na het bereiden wordt de homogeen bevonden bulksuspensie van 100 liter vanuit het voorraadvat uitgevuld in flesjes van 100 ml. Het voorraadvat wordt hiervoor aan de onderkant afgetapt onder voortdurend roeren. Een medewerker meldt echter aan de apotheker dat de roerder mogelijkerwijze niet gewerkt heeft. De apotheker besluit daarop een selecte steekproef te nemen door 3 flesjes uit het begin, 3 uit het midden en 3 uit het eind van de uitgevulde partij te nemen en het gehalte sulfamethoxazol vast te stellen. Per flesje wordt na goed homogeniseren 1 monster onderzocht volgens de Britse farmacopee en 1 volgens de USP.
|
BP |
USP |
|
|
begin 1 |
79,46 |
78,85 |
|
begin 2 |
79,75 |
77,34 |
|
begin 3 |
77,87 |
81,64 |
|
Midden 4 |
97,40 |
96,00 |
|
Midden 5 |
96,28 |
95,45 |
|
Midden 6 |
94,45 |
99,06 |
|
eind 7 |
50,59 |
51,32 |
|
eind 8 |
50,02 |
51,26 |
|
eind 9 |
50,45 |
50,36 |
a. Mag hier een Q-test uitgevoerd worden?
Ja, in de volgende gevallen mag een Q-test uitgevoerd worden: per methode per monsterplaats van 3 flesjes en door de verschillen te nemen van BP en USP waarden behorend bij 1 flesje.
b. Bereken het gemiddelde, de standaarddeviatie en het 99%-betrouwbaarheidsinterval van het gevonden gehalte per monsterplaats.
|
BP |
USP |
gepaard t |
|
|
begin 1 |
79.46 |
78.85 |
0.61 |
|
begin 2 |
79.75 |
77.34 |
2.41 |
|
begin 3 |
77.87 |
81.64 |
-3.77 |
|
gemidd |
79.03 |
79.28 |
|
|
sd |
1.01 |
2.18 |
|
|
99%bet |
5.80 |
12.49 |
|
|
Midden 4 |
97.40 |
96.00 |
1.4 |
|
Midden 5 |
96.28 |
95.45 |
0.83 |
|
Midden 6 |
94.45 |
99.06 |
-4.61 |
|
gemidd |
96.04 |
96.84 |
|
|
sd |
1.49 |
1.95 |
|
|
99%bet |
8.53 |
11.14 |
|
|
eind 7 |
50.59 |
51.32 |
-0.73 |
|
eind 8 |
50.02 |
51.26 |
-1.24 |
|
eind 9 |
50.45 |
50.36 |
0.09 |
|
gemidd |
50.35 |
50.98 |
-0.56 |
|
sd |
0.30 |
0.54 |
2.20 |
|
99%bet |
1.70 |
3.08 |
2.46 |
De t-waarde uit de tabel om het 99%-betrouwbaarheidsinterval van de gemiddelden te berekenen is: t(n=2;a=0.01;2zijdig)=9.92
De t-waarde uit de tabel om het 99%- betrouwbaarheidsinterval van het gemiddelde van de gepaarde t-toets te berekenen is t(n=8;a=0.01;2zijdig)=3.36
De Q-test per monsterplaats per methode geeft de hoogste waarde bij de USP aan het eind van de serie: 0.938 dit is kleiner dan 0.994
De Q test voor de verschillen per flesje bij begin 2 en midden 4: 0.144 dit is minder dan de Q-tabel 0.672 (n=9;a=0.01)
Er zijn dus geen uitbijters (a is 0.01)
c. Verschillen de gehaltes per monsterplaats van elkaar (a=0,01)?
[Opmerking: Als de betrouwbaarheidsintervallan erkaar niet overlappen zal de t-toets altijd uitwijzen dat de gemiddelden significant verschillend zijn. Andersom geldt dit niet en zal er via de F en t-toets significant verschil berekend moeten worden.]
Uit de berekeningen uit vraag 1b blijkt dat alleen de 99%-betrouwbaarheidsintervallen van het gemiddeld gehalte van begin en midden bepaald volgens de USP elkaar overlappen. Hiervoor dient dus nog met een F- en t-toets het significante verschil aangetoond te worden:
F-berekend: 1.258
F-tabel: 119.00 (n1=1,n2=2,a=0.01,2zijdig)
Uit de F-toets blijkt dat de standaarddeviaties niet significant van elkaar verschillen (a=0.01). De standaarddeviaties mogen dus gepoold worden.
sp = 2.07
t-berekend = 10.39
t-tabel = 4.6 ((np=4,a=0.01,2-zijdig)
Uit de t-toets blijkt dat het gemiddeld gehalte van begin en midden bepaald volgens de USP significant verschillen (a=0.01)
d. Verschillen de gehaltes per methode significant van elkaar (a=0,01)?
Door een gepaarde t-toets uit te voeren op de uitkomsten per flesje kan er een uitspraak gedaan worden over het significante verschil tussen beide methoden. Zie de tabel bij vraag 1b. Het 99%-betrouwbaarheidsinterval blijkt de nulwaarde te bevatten. De methoden komen dus significant met elkaar overeen (a = 0.01).
[Opmerking: Er wordt voor Q-test en de gepaarde t-test op de verschillen per flesje uitgegaan van een absolute fout in de methode. Als alternatief kunnen bij een relatieve fout de verschillen voor beide testen gewogen worden naar het gemiddelde gehalte]
e. De analist die de gehaltebepaling uitvoert, stelt voor om de hoeveelheid testmateriaal voor de analyse van de BP van 4 gram terug te brengen naar 100 mg. Op deze manier kan een verdunningsstap overgeslagen worden en daarmee wordt een aanzienlijke tijdsbesparing gerealiseerd. Welk effect verwacht u hiervan op de reproduceerbaarheid van de gehaltebepaling? Motiveer uw antwoord.
Bij 2-fasen systemen zoals bij suspensies is bij monstername de kans aanwezig dat er meer van de ene fase meekomt dan van de andere fase. Deze kans wordt groter naarmate men kleinere monsters neemt. De reproduceerbaarheid van de gehaltebepaling zal bij suspensies dus slechter worden bij kleinere monstername. De reproduceerbaarheids verbetering door het uitvoeren van minder verdunningsstappen is verwaarloosbaar.
f. Wordt het vermoeden dat de roerder niet gewerkt heeft gestaafd door de uitkomsten van de analyse?
Ja. De monsers uit begin, midden en eind van het uitvulproces verschillen significant van elkaar (a=0.01) terwijl de bulksuspensie homogeen bevonden is. De roerder heeft na het begin stil gestaan. Hierdoor zakt de suspensie uit en wordt er in het midden van het uitvulproces een hogere concentratie sulfamethoxazol gevonden dan verwacht en aan het eind een lagere.
Vraag 2
Vergelijk van de BP en USP monografie voor cotrimoxazole suspensie (zie bijlage)
a. Waarom wordt bij de gehaltebepaling van de BP gevraagd de dichtheid van de suspensie te meten en bij de USP niet?
Beide farmacopeeën geven het gehalte weer in gewicht per volume (BP in % m/v en de USP in mg per ml). De USP neemt een volume in bewerking en meet de respons hiervan tegen een afgewogen standaard. De BP neemt een afgewogen hoeveelheid in bewerking en meet de respons hiervan tegen een afgewogen standaard. Voor de omrekening van het gewicht naar het volume van het monster is een bepaling van de dichtheid van dat monster noodzakelijk.
b. Welke dichtheid van de suspensie volgt uit het bereidingsvoorschrift (zie bijlage).
De dichtheid is direct af te lezen uit het feit dat er voor 1 ml tot 1.121 g aangevuld dient te worden met water. De dichtheid bedraagt dus 1,121 g/ml
c. Bij de opwerking van de USP wordt een neerslag afgecentrifugeerd. Indien alleen de te bepalen stoffen oplossen in het voorgeschreven oplosmiddel, bereken dan wat de systematische fout is uitgedrukt in procenten. Ga voor de dichtheid van het neerslag uit van een waarde van 2. Geef ook aan of het gehalte daardoor te hoog of te laag uitvalt.
Het neerslag dat gevormd wordt door 1 ml monster in berwerking te nemen, heeft het volgende volume: (0.001 + 0.010 +0.010 + 0.166 + 0.00075) g : 2 g/ml = 0.0939 ml. Het volume dat door het methanol wordt ingenomen is dus 50 - 0.0939 = 49.906 ml. Na het afcentrifugeren blijven de te bepalen stoffen in een kleiner volume achter. Bij het opwerken van de standaard wordt geen neerslag afgecentrifugeerd. Het gehalte zal dus 100% x 50 : 49.906 = 100.188 % bedragen uitgaande van een gehalte van 100%. Deze fout is te verwaarlozen ten opzichte van de meetfout van de gebruikte HPLC methode.
d. De volgende dag analyseert een tweede analist de flesjes nogmaals volgens de USP en vindt een gemiddeld gehalte dat significant afwijkt van het gemiddeld gehalte van de eerste analist. De eerste analist heeft echter 10,0 g testoplossing overgebracht in een getarreerde centrifugebuis met stop en vervolgens met stop gecentrifugeerd. De tweede analist heeft 6,0 ml testoplossing in een centrifugebuis zonder stop gepipetteerd en vervolgens gecentrifugeerd. Kunt u het verschil in het gehalte van de eerste en tweede analist verklaren.
Na het centrifugeren wordt 5 ml van de testoplossing na centrifugeren verder opgewerkt. Het doet er dus niet toe hoe groot het volume of de hoeveelheid is die wordt afgecentrifugeerd.
Het afcentrifugeren van een organisch oplosmiddel in een open buis, geeft een aanzienlijke verdamping. De te bepalen stoffen worden daardoor geconcentreerd en zullen dus een systematisch hoger gehalte geven.
e. Geef aan of MOB de BP-gehaltebepaling van trimethoprim zou kunnen storen.
Trimethoprim wordt uit alkalisch milieu geëxtraheerd. Dit gebeurt bij een pH van ongeveer 13. Bij deze zuurtegraad is het MOB dat een pKa heeft van 8.4 bijna geheel geladen en wordt dus niet geëxtraheerd. De gehaltebepaling van trimethoprim zal dus niet door MOB gestoord worden.
f. Wat is de functie van het ammoniumsulfamaat bij de BP-gehalte bepaling van sulfamethoxazol?
Bij de opwerking is een reactietijd tussen sulfamethoxazol en nitriet omschreven teneinde de vorming van ongewenste nevenproducten te voorkomen. Met het ammoniumsulfamaat wordt de overmaat nitriet weggenomen.
Vraag 3
De suspensie bevat twee verdikkingsmiddelen, carmellose en aluminium magnesiumsilicaat.
a. Hoe verandert de viscositeit van de suspensie indien te veel citroenzuur bij de bereiding toegevoegd zou zijn?
Bij een pH van 5.0-6.5 is een deel van de carboxylgroepen van het carmellose geladen (vergelijk met carbomeer). Het molekuul is daardoor uitgerekt en dit geeft een viskeuze oplossing. Door te veel citroenzuur toe te voegen wordt het gedeelte geladen carboxylgroepen verkleind. Het molekuul "rolt" daardoor "op" en de viscositeit van de oplossing gaat daardoor omlaag.
b. U wilt aluminium en magnesium m.b.v. een AAS-bepaling kwalitatief aantonen. Beschrijf hoe u daarbij het monster zou opwerken.
Voor AAS moet het aluminiummagnesiumsilicaat geïsoleerd worden uit de matrix. Door voorzichtig droogdampen op een brander wordt het water verwijderd. Na verbranden en gloeien wordt al het organische materiaal verbrand en blijft alleen het aluminiummagnesiumsilicaat en een natriumzout over [opmerking: waarschijnlijk in de vorm van natriumsulfaat aangezien sulfamethoxazol een sulfaatgroep bevat]. Na wassen van het residu lost het natriumzout op. Volgens de monografie kan het aluminium en magnesium in oplosbare vorm gebracht worden door het te versmelten met watervrij natriumcarbonaat. Na wassen met warm water, kan het residu opgelost worden in zoutzuur R. Na een geschikte verdunning van de gevormde oplossing tot 1-10 ppm kan er d.m.v. AAS met een magnesium- en aluminiumlamp een signaal gemeten worden van de beide kationen.
Vraag 4
Hieronder is een afbeelding gegeven van de DLC van de in de USP beschreven test "limit of sulfanilamide, sulfanilic acid and sulfamethoxazole N4-glucoside". Enkele gegevens van deze onzuiverheden zijn aangegeven in de bijlage.
a. In het loopmiddel is azijnzuur toegevoegd. Kunt u aangeven wat de functie van het azijnzuur is en kunt u aangeven hoe het chromatografisch gedrag van deze stoffen wordt beïnvloed indien het azijnzuur weggelaten zou worden?
Het azijnzuur zorgt ervoor dat de ongeladen fractie van de relatief sterke zuren, zo groot mogelijk is (geladen molekulen zullen nagenoeg alle op het opbrengpunt blijven zitten door de grote affiniteit voor het silica). Bovendien verdringt het azijnzuur stoffen met erg veel polaire groepen, van het silica. Door azijnzuur weg te laten zullen de Rf-waarden dus kleiner worden. Sulfanilzuur is het sterkste zuur en zal bij het weglaten van het azijnzuur op de startvlek blijven zitten. De andere waarden zullen nauwelijks door het azijnzuur beïnvloed worden.
b. De USP geeft aan dat de Rf-waarden van sulfamethoxazol en de genoemde verontreinigingen in opklimmende volgorde 0,1; 0,25; 0,55; en 0,85 bedragen. Geef op grond van de structuur aan welke verbinding bij welke Rf-waarde hoort. Gegeven is dat de Rf-waarde van het glucoside 0,25 bedraagt .
Het genoemde DLC-systeem is een normal-phase systeem. Er wordt hierbij onderscheid gemaakt op grond van het verschil in aantal polaire groepen. Tevens speelt de fractie geladen stof een rol. Sulfanilzuur is vanwege zijn lage pKa waarde het meest in de geladen vorm en zal dus de meeste affiniteit hebben met de stationaire fase: Rf-waarde 0.1. Het N-4 glucoside heeft een Rf-waarde van 0.25. Het sulfanilamide is nagenoeg ongeladen, evenals het sulfamethoxazol zelf. Echter bij sulfanilamide is een vrije sulfonamide groep aanwezig en dus heeft deze stof meer affiniteit voor het silica dan sulfamethoxazol. Rf-waarde 0.55 en 0.82 respectievelijk.
c. Teken het vlekkenpatroon van de opgebrachte oplossingen indien een met octadecylgroepen gemodificeerd silicagel DLC systeem zou zijn toegepast met een aangezuurd methanol/water systeem als loopmiddel.
Dit DLC-systeem scheidt op grond van verschil in sovofobiciteit. Dit effect is weer afhankelijk van de molekuulgrootte en het aantal polaire groepen; hoe groter het molekuul en hoe minder polaire groepen, hoe groter het solvofoobeffect en hoe lager de Rf-waarden. Voor sulfanilzuur (C), sulfonamide (B) en sulfamethoxazol (A) neemt het aantal polaire groepen af en tevens de molekuulgrootte toe. De volgorde van deze stoffen is dus precies omgekeerd aan dat van het chromatogram in vraag 1c en de Rf-waarden zullen in het meest optimale loopmiddel verder uit elkaar liggen dan in het door de USP beschreven systeem. Voor het N-4 glucoside (D) is het effect moeilijker te voorspellen aangezien het aantal polaire groepen toeneemt en tevens het molekuul groter wordt. Waarschijnlijk zal de Rf waarde kleiner zijn dan sulfanilzuur maar groter dan dat van sulfamethoxazol.
d. Zijn de te chromatograferen oplossingen op een geschikte plaats opgebracht? Licht uw antwoord toe.
Aan de randen blijkt het vloeistoffront te vervormen. Het is beter om de oplossingen niet te dicht bij de rand op te brengen.
[Opmerking: Het is verstandig de oplossingen een paar keer op te brengen, waarbij de test omringt is door twee standaarden. De opbreng volgorde wordt dan bijvoorbeeld: A, T, B, C, T, D]
e. Een van de vlekken op de DLC is afgeplat. Welk chromatografisch effect is hiervoor waarschijnlijk verantwoordelijk?
De afgeplatte vorm is te wijten aan het optreden van een secundair vloeistoffront.
f. U wilt dit DLC-systeem gebruiken om de identiteit van sulfamethoxazol vast te stellen. Welke wijziging(en) voert u door om het systeem hiervoor geschikt te maken?
De Rf-waarde moet liggen tussen de 0.2 en 0.8. De Rf-waarde moet dus iets omlaag gebracht worden. Dit kan door het loopmiddel iets apolairder te maken door bijvoorbeeld de chloroform te verhogen ten koste van de hoeveelheid alcohol/methanol mengsel. [Opmerking: door de hoeveelheid opgebracht sulfamethoxazol te verminderen kan een mooiere ronde verkregen worden].
10 augustus 2000
Staf Farmaceutische Analyse 5e-jaar