Bij het content uniformity onderzoek vindt de apotheker de volgende uitkomsten:

Vraag 1

a. Bereken het gemiddelde gehalte, de standaarddeviatie en het bijbehorende 95% betrouwbaarheidsinterval uit de uitkomsten van de gehaltebepaling (Assay).

Aangezien het mengmonster in principe homogeen is, kan er via de dixons Q-test op uitbijters getoetst worden.

Qtest meest afwijkende waarde: | (98,7 - 100,8) / (98,7 -104,3) | = 0,38

Qtest tabelwaarde (a =0,05; n=6) : 0,56

De berekende waarden zijn kleiner dan de getabelleerde waarde. Volgens de uitgevoerde test zijn er in de reeks voor de gehaltebepalingen geen significante (a =0,05) uitbijters.

Gemiddelde: 101,7 mg.

Standaarddeviatie (S₁): 1,92 mg

95% betrouwbaarheidsinterval: 101,7 +/- 2,57*1,92 / (6^0.5) -> 101,7 +/- 2,02 -> 99,7 - 103,7 mg

De bijbehorende t-waarde uit de tabel is als volgt gevonden: t( a =0,05; df =5; 2-zijdig)=2,57

De reeks uitkomsten van het content uniformity onderzoek is verkregen uit verschillende tabletten. Een Q-test mag dus hier niet toegepast worden.

[Opmerking: een waarde uit een content uniformity onderzoek mag alleen verworpen worden als de betrouwbaarheid ervan betwijfeld kan worden door geconstateerde (en gedocumenteerde!) afwijkingen tijdens de analyse.]

Gemiddelde: 105,2 mg

Standaarddeviatie (S₂): 1,74

De bijbehorende t-waarde uit de tabel is als volgt gevonden: t( a =0,05; df = 9; 2-zijdig)=2,26

F-tabel ( a =0,05; df =5; df =9;2-zijdig) = 4,48

[NIET juist is F-tabel ( a=0,05; df = 9;df =5;2-zijdig) = 6,68]

Uit bovenstaande test blijkt dat de standaarddeviaties niet significant verschillen ( a=0,05).

[Opmerking: de uitkomst van deze berekening ligt altijd tussen de waarden van beide standaarddeviaties in! Met dit gegeven kun je heel gemakkelijk de uitkomst schatten. Zo is heel snel te zien of b.v. het worteltrekken vergeten is.]

t_berekend: [105,2-101,7] / [1,81 * { (1/6 + 1/10) ^ 0.5 } ] = 3,74

De gemiddelden van het gehalte- en gehaltespreidingsonderzoek verschillen significant (a =0,05) van elkaar.

Alternatief antwoord:

Aangezien de 95%-betrouwbaarheidsintervallen van het gehalte- en gehaltespreidingsonderzoek elkaar niet overlappen, kan geconcludeerd worden dat het gemiddelde van de uitkomsten van beide onderzoeken significant (a =0,05) van elkaar verschillen.

d. Geef aan of een eventueel optredend beperkt significant verschil in dit geval bezwaarlijk zou zijn.

Nee, niet per definitie: een beperkt significant verschil tussen gehalte- en gehaltespreidingsonderzoek is toegestaan. Het gehaltespreidingsonderzoek heeft tot doel de juiste spreiding in het gehalte te meten.

[Opmerking: De gebruikte bepalingsmethode voor het spreidingsonderzoek moet wel precies zijn, maar hoeft niet juist te zijn.]

Om de uitkomsten van gehalte en spreidingsonderzoek met elkaar te kunnen correleren moet het content uniformity onderzoek uitgebreid worden met een gehaltebepaling van het mengmonster met behulp van de bepalingsmethode van het gehaltespreidingsonderzoek. Van de gemiddelde gehaltes van het mengmonster, bepaald via de "assay methode" (gemA) en "content uniformity methode" (gemC), wordt het quotiënt berekend (gemA/gemC). Vervolgens worden de uitkomsten van het spreidingsonderzoek vermenigvuldigd met dit quotiënt.

Vraag 2

a. Is het UV-spectrum van betaxolol afhankelijk van de pH van de oplossing ?

Nee. Binnen het pH bereik van 0 tot 14 wordt alleen het stikstof atoom geprotoneerd. Dit stikstofatoom is niet geconjugeerd met de chromofoor, de oxy-benzeenring, van het molecuul. Een pH-shift zal daardoor niet optreden.

Ja, mits het betaxololhydrochloride oplost in azijnzuuranhydride is het chloride-ion kwantitatief te protoneren met perchloorzuur.

Een directe titratie in watervrij azijnzuur is niet mogelijk omdat de stikstof al geprotoneerd is en het chloride-ion in dat milieu een te zwakke base is. Een indirecte methode met mercuriacetaat is wel mogelijk, maar vanuit milieu-oogpunt niet aan te raden.

Suspendeer een hoeveelheid gepoederde tabletmassa, overeenkomend met 100 mg Betaxolol, in een reageerbuis met 10 ml water. Schud de suspensie 1 min. m.b.v. een vortex. Filtreer over een papierfilter (of centrifugeer 5 min bij 1500 rpm). Het filtraat (of supernatant) moet helder zijn. Voeg 20 ml NaOH 0,1 M toe aan het filtraat (of supernatant). Er ontstaat waarschijnlijk een wit neerslag. Breng dit mengsel over in een scheitrechter van 100 ml. Voeg 10 ml chloroform toe en schud. Laat de fasen ontmengen (de fasen zijn waarschijnlijk helder) en breng de chloroformlaag over in een andere scheitrechter. Was de chloroformlaag met 5 ml water. laat de fasen ontmengen en filtreer de chloroform over een papierenfilter met 1 g watervrij natriumsulfaat in een getarreerd indampschaaltje van 100 ml. Damp de oplossing droog op het waterbad en bepaal de opbrengst. Schraap de massa uit het schaaltje en neem volgens procedure een infrarood spectrum op.

Opmerking: de kans op ontleding wordt, gezien de structuurformule, niet groot geacht. Uit voorzorg dient de opwerking zo snel mogelijk te geschieden.

De apotheker is betrokken bij een researchproject waarbij de werkzaamheid van esters van betaxolol (als prodrugs) geëvalueerd wordt. De projectleider verzoekt de apotheker een bloedspiegelbepaling te ontwerpen waarbij betaxolol en de acetylester van betaxolol naast elkaar in serum aangetoond kunnen worden. Hij wil bovendien weten wat de gevoeligheid van de betreffende analysemethode is.

Bij HPLC berust de scheiding op verschil in solvofobiciteit. De solvofobiciteit wordt beïnvloed door het aantal polaire groepen en de grootte van het molecuul. Door acetyleren verdwijnt een polaire hydroxylgroep en wordt het molecuul groter. Beide effecten vergroten de retentietijd en daarom is een HPLC methode in beginsel geschikt voor een Betaxolol van zijn acetylester te scheiden.

De acetylester is groter apolair en heeft 1 hydroxylgroep minder dus het hydrofoob effect is groter. Hierdoor wordt deze stof uit de mobiele fase verdreven en zal dus meer op de stationaire fase blijven zitten. De acetylester heeft daarom later van de kolom geëlueerd worden.

________________________________________________________________________

Opmerking: de detectie- en bepalingsgrens zijn arbitrair en niet eenduidig vastgelegd. De grootorde van de grenzen liggen ongeveer in de buurt van hetgeen hieronder uitgewerkt is.

a. Geef aan hoeveel de minimaal detecteerbare hoeveelheid betaxolol (in mg) bedraagt.

Stel: de detectiegrens is gelijk aan 3 keer de ruis Dit komt overeen met een signaal van:

3 * 0,01* 0,01 = 3 * 10^-4 AUFS.

Uit de gegevens in de vraag is te berekenen welk aantal �g Betaxolol een signaal geeft van 0,1 AUFS.

10 [�l injectie] * (2000 * 1000 /50,7) [�g Betaxolol] / (100 * 1000) [�l oplosvolume] wat overeenkomt met 4 �g

De dectectiegrens is dus 4 * 3 * 10^-4 / 0.1 = 1,2 * 10^-2 �g Betaxolol.

Stel: de bepalingsgrens is gelijk aan 10 keer de ruis. Dit komt overeen met een signaal van

10 * 0,01 * 0,01 = 1* 10^-3 AUFS.

De bepalingsgrens is dus 4 * 1 * 10^-3 / 0.1 = 4 * 10^-2 �g Betaxolol

________________________________________________________________________

In de Britsche Farmacopee 1998 wordt het preparaat Sodium Bicarbonate Ear Drops beschreven (zie bijlage).

Vraag 5

a. Geef een methode om het bicarbonaatgehalte te bepalen

1.Titreren met zoutzuur. Voor het eindpunt van de titratie moet de oplossing even gekookt worden om de nog opgeloste kooldioxide te verwijderen.

òf

2. Titreren met natronloog na toevoegen van overmaat zoutzuur en koken.

Natrium wordt bepaald met vlamemissiespectrometrie en glycerol zou kunnen storen doordat het de viscositeit en de oppervlaktespanning van de testoplossing beïnvloed. Het concentratie gebied waarin natrium betrouwbaar gemeten kan worden is 1- 10 ppm. Voor een bepaling werkt men bij voorkeur in het midden van het lineaire gebied, dus bij 5 ppm. Dit betekent dat voor een 5 ppm oplossing het preparaat verdund moet worden met een verdunningsfactor van 10.000 (aangenomen, dat de dichtheid van het preparaat niet al veel van 1 afwijkt).
De concentratie van glycerol wordt daarmee dusdanig laag dat de viscositeit en oppervlaktespanning geheel bepaald wordt door het zoutzure milieu van de testoplossing. Standaardadditie kan ook toegepast worden om een eventuele storing van glycerol op te heffen.

c. Geef aan in hoeverre de gehaltebepaling van glycerol zoals beschreven in de Europese Farmacopee (zie bijlage) in dit preparaat toegepast kan worden.

Bij de titratie in de farmacopee wordt glycerol omgezet in een zuur (mierezuur) dat met natronloog getitreerd wordt. Het in de oordruppels aanwezige bicarbonaat reageert echter ook met het gevormde zuur en zal de bepaling dus storen. De oplossing is nog wel te titreren indien de oplossing gekookt wordt en er gecorrigeerd wordt voor het aantal equivalenten bicarbonaat. Dit aantal equivalenten dient bij de hoeveelheid verbruikte loog opgeteld te worden.

Met een bekende overmaat perjodaat in zuur milieu worden de twee vicinale alcoholgroepen van glycerol geoxideerd. De overmaat perjodaat zet jodide in alkalisch milieu om in jood dat vervolgens met een bekende overmaat arseniet wordt gereduceerd (perjodaat reageert niet direct met arseniet, jood fungeert daarbij als een "katalysator"). De overmaat arseniet wordt getitreerd met jood. Bij de eerste geelkeuring van de oplossing wordt het eindpunt afgelezen. Er wordt tevens een blanco bepaling uitgevoerd.

Na de omzetting van de overmaat perjodaat met jodide kan het gevormde jood ook bepaald worden met een arsenietoplossing van bekende sterkte. Het eindpunt moet dan potentiometrisch vastgesteld worden.

Testosteronenantaat (zie bijlage) wordt in de vorm van een oplossing in plantaardige olie via een intramusculaire injectie toegediend. De gebruikelijke concentratie in een dergelijk preparaat bedraagt 180 mg/ml .

Testosteronenantaat kan het beste geïsoleerd worden m.b.v. een extractiesysteem met een zo laag mogelijke verdelingscoëffiënt. Het standaard extractiesysteem daarvoor is petroleumether/70%ethanol. Er wordt 3x geëxtraheerd met een vierde extract om de volledigheid van de extractie te verifiëren.

Isolatie is niet noodzakelijk omdat in een "normal phase" systeem, het product opgelost wordt in een relatief apolair loopmiddel zodat vette hulpstoffen gemakkelijk daarin opgelost kunnen worden in tegenstelling tot de relatief polaire loopmiddelen die bij een "reversed phase" kolom gebruikt worden.

Het aanwezige opgeloste vet kan wel in enkele gevallen het chromatografisch gedrag verstoren.

Impurity A is een kleiner molecuul (1 C-atoom minder) dan testosteronenantaat (verder afgekort met TE) met dezelfde polaire groepen en heeft dus een kleiner hydrofoob effect dan TE. Impurity A zal dus iets eerder van de kolom eluëren, maar het verschil zal niet groot zijn.

Impurity B is qua grootte gelijk aan TE. Er ontbreekt echter een dubbele binding is het koolstofskelet. Dit verschil heeft nauwelijks effect op de hydrofobiciteit zodat er bijna geen verschil is in retentie tussen impurity B en TE.

Impurity C heeft een vrije hydroxylgroep en is kleiner en zal dus veel eerder van de kolom eluëren als TE, impurity A en B.

Op ongemodificeerd silica vindt scheiding alleen plaats op grond van verschil in polaire groepen. Stoffen met de meeste polaire groepen eluëren het traagst.

Op grond van dit gegeven zal er dus geen retentie verschil zijn tussen impurity A en testosteronenantaat. Het gedrag van impurity B verschilt wederom nauwelijks van TE. Impurity C heeft de grootste retentie op dit chromatografisch systeem gezien de verschillen in molecuulstructuur die bij het antwoord op vraag 6 C zijn aangegeven.