Een apotheker besluit capsules te maken met 5 mg dexamethason. Hij gebruikt hierbij lactose als hulpstof in plaats van het daarvoor gangbare primojelcapsulevulmengsel. Omdat zijn assistente klaagt over problemen bij het vullen van de capsules besluit de apotheker deze te analyseren. Eerst bepaalt de apotheker het gewicht van 10 lege capsules uit de gebruikte charge. Dit bedraagt 590,3 mg. Na weging van de gevulde capsules afzonderlijk brengt hij de inhoud ervan volledig over in een maatkolf van 200 ml. Hij brengt de dexamethason in oplossing door toevoeging van 100 ml methanol gevolgd door ultrasone behandeling. De verkregen suspensie verdunt hij vervolgens met water tot 200,0 ml. Hierbij ontstaat een heldere oplossing.
Als eerste bepaling voert de apotheker een UV-meting uit. Omdat de gevonden gehalten verder uiteenliggen dan hij verwacht had, vermoedt hij dat er mogelijk UV-absorberende verontreinigingen aanwezig zijn. Hij besluit daarom de monsteroplossingen nogmaals te onderzoeken met HPLC op een RP-18 kolom met een loopmiddel bestaande uit 50% methanol in water.
Vraag 1.
De berekende waarden staan vermeld in de onderstaande tabel.
a. Bereken het gemiddeld capsulegewicht en de spreiding daarin.
Het gemiddeld capsulewicht bedraagt 226,9 mg. Voor de standaarddeviatie wordt 4,69 gevonden. Het gewicht van de inhoud bedraagt gemiddeld 167,8 mg
Is het gebruik van het gemiddeld leeg capsulegewicht toegestaan bij de bepaling van de gewichtsspreiding van de capsule-inhoud (uniformity of mass ?
Voor de bepaling van de gelijkmatigheid van gewicht dient per capsule het nettogewicht bepaald te worden door van het brutogewicht (capsule+inhoud) het tarragewicht (lege capsule) af te trekken. De spreiding die uit de uitkomsten berekend wordt is die van het vulproces.
Door met het gemiddeld gewicht van de lege capsules te rekenen vindt men een variantie die de som is van de variantie van het vulproces en variantie van het gewicht van de lege capsules. Het is dus formeel onjuist om met een gemiddeld leeg capsulegewicht te rekenen. Indien van te voren vast staat dat de spreiding in het gewicht van de lege capsules veel kleiner is dan die in de gevulde capsules, dan mag de spreiding in het lege capsulegewicht verwaarloosd worden.
Geef aan in hoeverre op grond van deze steekproef vastgesteld kan worden of de capsules aan de eisen van gelijkmatigheid van gewicht volgens de Europese Farmacopee voldoen.
Voor de bepaling van de gelijkmatigheid van het gewicht van de capsule-inhoud (uniformity of mass) moet een steekproef van 20 capsules genomen worden. Hier is sprake van een steekproef van 10 capsules, de steekproef is dus te klein. De rekenregel van de Europese farmacopee kan dan niet toegepast worden.
De toegelaten spreiding in het capsulegewicht is 10%, dus 16,8 mg. De standaarddeviatie in het bruto capsulegewicht bedraagt 4,69.
De tabel met kritische waarden voor de eenzijdige t-toets geeft aan dat bij 9 vrijheidsgraden, de kritische waarde voor 1% betrouwbaarheid 2.82 bedraagt. Dit betekent, dat de kans om een capsule aan te treffen met een afwijking die groter is dan 16,8 mg kleiner is dan 1%.
De spreiding in het capsulegewicht is zo klein dat de kans om een capsule aan te treffen die buiten de grenzen voor de gelijkmatigheid van gewicht valt te verwaarlozen is.
b. Bereken de gemiddelde capsulegehalten volgens de UV- en de HPLC-bepaling en de spreidingen daarin. Bereken of deze gehalten significant (95% betrouwbaarheid) van de gedeclareerde waarde afwijken.
De gedeclareerde waarde ligt voor beide bepalingsmethoden binnen het 95% betrouwbaarheidsinterval.
c. Voldoen de capsules aan de eisen voor de gelijkmatigheid van gehalte volgens de Europese Farmacopee ?
De tiende capsule wijkt meer dan 30 procent af van het gemiddelde capsulegehalte. De capsules voldoen daarom niet aan het criterium voor gelijkmatigheid van gehalte, noch volgens de UV-, noch volgens de HPLC-bepaling.
Moeten deze capsules juridisch aan de eis voor de gelijkmatigheid van gehalte voldoen ?
Het gehalte aan dexamethason is hoger dan 2 mg en hoger dan 2%. Juridisch behoeft er geen onderzoek naar de gelijkmatigheid van gehalte verricht te worden. Dit betekent echter niet, dat deze capsules niet aan de betreffende eisen moeten voldoen. Het onderzoek naar gelijkmatigheid van gehalte is voorgeschreven omdat bij kleine hoeveelheden en lage concentraties het probleem van ontoereikende menging een risico is, dat moet worden uitgesloten. Indien de hoeveelheden en/of concentraties groter zijn dan de aangegeven grenzen betekent dat echter niet dat daardoor een ontoereikende menging wel aanvaardbaar is.
|
capsulenr |
capsulegewicht in mg |
gehalte in mg volgens UV-bepaling |
gehalte in mg volgens HPLC bepaling |
verschil UV-HPLC |
|
1 |
236.6 |
4.51 |
4.58 |
-0.07 |
|
2 |
223.7 |
4.79 |
4.73 |
0.06 |
|
3 |
232.1 |
4.44 |
4.43 |
0.01 |
|
4 |
225.7 |
4.82 |
4.60 |
0.22 |
|
5 |
223.9 |
5.23 |
5.68 |
-0.45 |
|
6 |
224.1 |
4.13 |
4.10 |
0.03 |
|
7 |
228.6 |
4.37 |
4.56 |
-0.19 |
|
8 |
227.9 |
4.37 |
4.31 |
0.06 |
|
9 |
220.4 |
4.91 |
5.05 |
-0.14 |
|
10 |
225.5 |
6.64 |
6.33 |
0.31 |
|
gemiddelde |
226.85 |
4.82 |
4.84 |
-0.02 |
|
standaarddeviatie |
4.69 |
0.72 |
0.68 |
0.21 |
|
variatiecoefficient |
2.07 |
14.85 |
14.09 |
|
|
95% betrouwbaarheids-interval |
||||
|
ondergrens |
4.31 |
4.35 |
-0.17 |
|
|
bovengrens |
5.33 |
5.32 |
0.14 |
|
Vraag 2.
a. Wijken de uitkomsten van de HPLC- en de UV-bepaling significant (95% betrouwbaarheid) van elkaar af ?
Bij de uitvoering van de gepaarde t-toets blijkt, dat de waarde 0 binnen het 95% betrouwbaarheidsinterval ligt. De uitkomsten van de UV- en de HPLC-bepaling wijken dus niet siginificant van elkaar af.
b. Blijkt uit de verkregen meetwaarden dat er bij de UV-bepaling sprake is van een invloed van UV-absorberende verontreinigingen ?
Bij aanwezigheid van UV-absorberende verontreinigingen mag men aannemen dat deze bij een HPLC-bepaling van dexamethason gescheiden worden. Daardoor zou de HPLC-bepaling bij de aanwezigheid van UV-absorberende verontreinigingen in de te onderzoeken monsters significant lager moet uitkomen dan de UV-bepaling (tenzij de invloed van de verontreinigingen zo klein is, dat deze te verwaarlozen is ten opzichte van de standaarddeviaties van de HPLC en de UV-bepalingen).
c. Is de spreiding in het capsulegehalte bij deze capsules te wijten aan een probleem bij het mengen of aan een probleem bij het vullen van de capsules ?
De gewichtsspreiding bedraagt 2,07%. De spreiding in het gemiddeld capsulegehalte bedraagt 14,85 (UV-bepaling) en 14,09 (HPLC-bepaling). De F-test voor de vergelijking van deze spreidingen levert een waarde van 51,64 voor de UV-bepaling en van 46,52 voor de HPLC-bepaling. Dit getal is veel groter dan de kritische waarde 3,18 (éénzijdig bij een 1% significantie-niveau) en 5,35 (éénzijdig bij een 5% significantie-niveau)
Dus de gehaltespreiding moet het gevolg zijn van de slechte menging.
d. De spreiding in de uitkomsten volgens HPLC- en de UV-bepaling wordt veroorzaakt door de spreiding ten gevolge van de menging van de grondstoffen, het vullen van de capsules en de precisie van de analytische bepaling. Geef aan welke uitspraak er op grond van de gemeten waarden over de precisie van de analytische bepalingen gedaan kan worden.
De standaarddeviatie van het verschil van tussen de UV- en de HPLC-bepaling bedraagt 0,21. Dit betekent dat de standaarddeviaties in de afzonderlijke analysemethoden kleiner zijn dan deze waarde. De spreiding door de menging van de grondstoffen en de vulling van de capsules speelt hierin geen rol omdat de uitkomsten van de beide gehaltebepalingen per capsule met elkaar vergeleken worden.
Vraag 3:
a. Welke extinctie heeft de apotheker (bij gebruik van 10 mm cuvetten) gemeten ?
De concentratie van de te onderzoeken oplossing bedraagt gemiddeld 2,4 mg/100 ml. De specifieke extinctie bedraagt 394. De gemeten extinctie bedraagt dan 0,95.
Is deze extinctie een acceptabele waarde ?
Deze extinctie valt buiten het traditionele meetgebied van 0,2 tot 0,8. Op de heden ten dage gangbare apparatuur kan een extinctie van 0,95 echter wel gemeten worden.
b. Hoe is op analytische wijze te controleren of de verontreinigingen in de matrix de UV-bepalingen storen ?
Door de vorm van het UV-spectrum van de monsters te vergelijken met dat van de standaard kan vastgesteld worden of er sprake is van storende verontreinigingen.
Een atlete heeft in haar sportschool ampullen gevonden, die met een lichtgele olieachtige vloeistof gevuld zijn. Omdat het gerucht gaat, dat er in de sportschool illegale injecties met nandrolon toegediend zouden worden, laat zij de ampullen door de plaatselijke ziekenhuisapotheker onderzoeken.
Volgens de literatuur zou nandrolon meestal in de vorm van nandrolonfenylpropionaat of nandrolondecanoaat in oplossingen van plantaardige oliën toegediend worden.
Vraag 4:
a. Geef aan hoe de apotheker deze verbindingen uit de olie zou moeten isoleren als voorbereiding op een HPLC-analyse op een RP-18 kolom.
Het ligt voor de hand om hier een twee-fasische extractie met petroleumether / 70% ethanol (of een verwant systeem) toe te passen.
b. Zouden deze beide verbindingen op een RP-18 HPLC-kolom gescheiden kunnen worden en, zo ja, welke verbinding zou dan het eerst geëlueerd worden ?
De toegepaste HPLC-scheiding berust op verschillen in solvofoob effect. Decanoaat heeft één koolstofatoom meer en heeft op grond daarvan meer retentie. Het gevonden verschil is nog groter doordat de fenylpropionylgroep compacter is en de fenylkern bovendien polairder is dan een alifatische alkylgroep. Deze beide eigenschappen verlagen het solvofobe effect en dus de retentie van de fenylpropionylester.
Vraag 5
a. Geef aan of er spectrale verschillen zijn in de spectra van de beide nandrolonesters.
De chromofoor van nandrolonundecanoaat wordt gevormd door de carbonylgroep in combinatie met de daarnaast gesitueerde dubbele band. De fenylkern van het nandrolonfenylpropionaat veroorzaakt eveneens UV-absorptie. De spectrale bijdrage ervan heeft het voor de fenylgroep karakteristieke spectrum. De fenylkern vertoont echter slechts een geringe lichtabsorptie zodat het effect ervan op het spectrum van nandrolonfenylpropionaat gering is.
Een apotheker onderzoekt een injectievloeistof met morfine voor epiduraal gebruik.
Het bereidingsvoorschrift voor dit preparaat luidt als volgt:
Vraag 6
a. Geef aan of de morfine in dit preparaat via een meting van de UV-extinctie bepaald kan worden en of het spectrum van morfine pH-afhankelijk is.
Morfine vertoont UV-absorptie, de overige bestanddelen van de injectievloeistof niet. De morfineconcentratie bedraagt 2 g/100 ml. Dit komt overeen met een extinctie van 104. Hieruit volgt dat voor een extinctiemeting de injectievloeistof 200x verdund moet worden. De morfineconcentratie is ruim toereikend.
Morfine is een amfotere stof. De pKa van 8,2 behoort bij de tertiaire aminogroep. De pKa van 10 wordt veroorzaakt door de fenolgroep. Omdat de fenolgroep aan de chromofoor gekoppeld is treedt er bij de deprotonering van de fenolgroep, dus rond pH 10 een verschuiving in het UV-spectrum op.
b. Geef aan hoe morfine uit dit preparaat als base geïsoleerd moet worden om hiervan een IR-spectrum te kunnen maken.
Om morfine als base te isoleren moet de extractie bij een pH die in ligt tussen de beide pKa-waarden uitgevoerd worden, dus omstreeks pH 9.
Voor een dergelijke extractie wordt een systeem als chloroform/water gebruikt.
Omdat morfine betrekkelijk polair is wordt bij de extractie vaak isopropanol of ethanol toegevoegd.
Geef aan welke voorzorgen u neemt om sporen water en reagentia te verwijderen.
Door de extracten na afloop van de scheiding van de fasen met een weinig water te schudden (te wassen) worden eventuele reagentia verwijderd. Het water wordt hierna verwijderd door de extracten te drogen door filtratie door een droog papieren filter of door te schudden met een weinig uitgedroogd natriumsulfaat.
c. Geef aan hoe in dit preparaat het gehalte aan natrium en aan chloride bepaald kan worden.
Geef bij eventueel gekozen titraties aan op welke wijze het eindpunt bepaald wordt en welke indicatoren en/of electroden daarbij gebruikt dienen te worden.
Natrium kan in een dergelijk monster bepaald worden met behulp van vlamemissiespectrometrie (AES).
Chloride wordt bepaald door titratie met zilvernitraat. Deze titratie kan potentiometrische gevolgd worden met behulp van een zilverelectrode als indicator-electrode en een double-junction referentie-electrode.
De titratie kan ook uitgevoerd worden door toevoeging van een overmaat zilvernitraat en terugtitratie van deze overmaat met kaliumthiocyanaat op ferriammoniumsulfaat als indicator (titratie volgens Volhardt). Om te voorkomen dat het toegevoegde thiocyanaat met het zilverchlorideneerslag reageert wordt dit omhuld met dibutylftalaat.
Gezien de pH van de oplossing ligt een directe titratie met zilvernitraat op kaliumchromaat als indicator (titratie volgens Mohr) minder voor de hand.
Welke van deze beide bepalingen (natrium of chloride) verdient de voorkeur wanneer men daarmee de isotonie van de oplossing wil vaststellen ?
De uitkomst van de chloride titratie geeft exact aan hoeveel negatieve (en dus ook hoeveel postieve) ionen er aanwezig zijn. Omdat er geen ongeladen moleculen in deze bereiding voorkomen ligt hiermee het totaal aantal deeltjes en dus ook de osmotische waarde vast.
d. Geef aan op welke wijze vastgesteld kan worden of de toegevoegde hoeveelheid zoutzuur correct is.
De functie van het zoutzuur is hier het instellen van de gewenste pH. De controle van de correcte hoeveelheid is daarom de bepaling van de pH.
8 april 2002
Staf Farmaceutische Analyse 5e-jaar