Vraag 1
Een student heeft op het practicum recepteerkunde 30 capsules gemaakt van de volgende samenstelling:Vraag 2Binnen het kader van geïntegreerd onderwijs wordt aan een tweede student gevraagd een onderzoek te doen naar de gelijkmatigheid van gehalte van deze capsules. Hij onderzoekt hiervoor tien capsules door de inhoud van elk van de capsules afzonderlijk kwantitatief over te brengen in een maatkolf en met methanol tot 50,0 ml aan te vullen. Na omschudden filtreert hij de verkregen oplossing en vult 10,0 ml hiervan aan tot 50,0 ml. Hij meet de extinctie van de verkregen oplossing bij 253 nm en vindt de volgende gehalten:
- medazepam 5 mg
- microkristallijne cellulose q.s. ad capsules nr 2
a. Is het correct om hier op de gevonden uitkomsten een Q-test toe te passen ?
capsule
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
gehalte in mg
2,56
4,94
2,84
2,94
3,11
1,98
2,50
2,15
2,23
3,52
Nee, een uitbijter kan ook wijzen op een capsule met een sterk afwijkend gehalte.b. Bereken het gemiddeld gehalte en de standaard deviatie in het gehalte van de capsules.
Het gemiddeld gehalte bedraagt 2,88 mg per capsule. De standaardafwijking van de capsule-populatie bedraagt 0,86 mg. De standaardafwijking in het gemiddelde uit een steekproef van 10 capsules bedraagt 0,27 mg.c. Wijkt het gevonden gemiddeld gehalte significant (95 % betrouwbaarheidsinterval) af van het gedeclareerde gehalte ?
Voor een steekproef van 10 waarnemingen ( 9 vrijheidsgraden) bedraagt de kritische waarde voor de t-test (tweezijdig, bij een 95% betrouwbaarheidsinderval) 2.26. Het 95% betrouwbaarheids interval van het gemiddelde capsulegehalte loopt dan van 2,27 tot 3,49 mg. Het gedeclareerd gehalte van 5 mg ligt ver hierbuiten. Het gemiddeld capsulegehalte wijkt dus significant af van de gedeclareerde waarde.d. Aan welke eisen moeten deze tien capsules voldoen met betrekking tot de gelijkmatigheid van gehalte (uniformity of content volgens de Europese Farmacopee)? Voldoen de capsules, gezien de analyse-uitkomsten, aan deze eis ?
De desbetreffende tekst van de Europese Farmacopee luidt:The preparation complies with the test if not more than one individual content is outside the limits of 85 per cent to 115 per cent of the average content and none is outside the limits of 75 per cent to 125 per cent of the average content. The preparation fails to comply with the test if more than three individual contents are outside the limits 85 per cent to 115 per cent of the average content or if one or more individual contents are outside the limits of 75 per cent to 125 per cent of the average content.Het bereik van 85% tot 115% van het gemiddelde loopt van 2,45 tot 3,31 mg. Vijf capsules liggen buiten dit bereik. Het bereik van 75% tot 125% loopt van 2,16 tot en met 3,60 mg. Drie capsules liggen buiten dit bereik.
Het preparaat voldoet dus niet aan de gestelde eisen.e. Wat is het gemiddelde van de extincties die deze student heeft gemeten ? Is de voor de meting gekozen verdunning correct ?
De specifieke extinctie van medazepam bedraagt 860. Indien het gehalte juist geweest zou zijn, zou de concentratie van de te meten oplossing 10/50 * 5 mg per 50 ml, of wel 0,002 g / 100 ml bedragen.
Deze oplossing zou een extinctie van 860 * 2,00/1000 = 1,72 moeten vertonen. Uit het gevonden gemiddeld gehalte van de capsules van 2,88 mg volgt dan dat de extinctie van de gemeten oplossing gemiddeld 0,99 bedroeg. Deze extinctie ligt buiten het voor analyses aanbevolen extinctiebereik van 0,2 tot 0,8. Voor de te verwachten extinctie van 1,72 geldt dit nog veel sterker. Het ware beter geweest bij de verdunning 5,00 ml te pipetteren in plaats van de 10,0 ml.De student die de capsules bereid heeft gaat niet accoord met de uitkomsten van deze analyse. Zij is van mening, dat zij de capsules wel degelijk op correcte wijze bereid heeft. Haar recepteerkunde-docent, die in het kader van de registratie volgens de opiumwet haar weging gecontroleerd heeft, verklaart dat wel degelijk de correcte hoeveelheid is afgewogen en verwerkt. Bovendien heeft de docent de indruk dat de student de bereiding juist heeft uitgevoerd. Zowel de docent als de student vragen zich af of er wellicht ontleding opgetreden is tijdens de analyse.
Een derde student wordt ingeschakeld om de analyseresultaten te controleren. Omdat de voor de extinctiemetingen gebruikte oplossingen nog niet weggegooid zijn analyseert zij deze met HPLC. Zij vindt hierbij de volgende uitkomsten:f. Verschillen de uitkomsten van de HPLC analyses significant van die van de UV-metingen ?
capsule
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
gehalte in mg
2,53
4,94
2,73
2,88
3,02
2,02
2,45
2,19
2,27
3,48
Uit de waarnemingen blijkt dat de verschillen tussen de analysemethoden veel kleiner zijn dan die tussen de capsules onderling. Dit betekent, dat voor de beantwoording van de vraag een gepaarde t-toets moet worden uitgevoerd. Het verschil tussen de beide methoden bedraagt gemiddeld 0,03. De standaarddeviatie van de populatie van de verschillen tussen de beide meetmethoden bedraagt 0,054. De standaarddeviatie in het gemiddelde verschil bedraagt dan 0,017. Het 95% betrouwbaarheidsinterval loopt dan van -0,013 tot 0,065. Het verschil tussen de uitkomsten van de beide bepalingsmethoden wijkt dus niet significant af van 0. De veronderstelling dat de beide methoden significant verschillende uitkomsten geven moet dan ook worden verworpen.
capsule
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
UV-meting
2,56
4,94
2,84
2,94
3,11
1,98
2,50
2,15
2,23
3,52
HPLC-meting
2,53
4,94
2,73
2,88
3,02
2,02
2,45
2,19
2,27
3,48
verschil
0,03
0,00
0,11
0.06
0.09
-0,04
0,05
-0,04
-0,04
0.04
g. Geven de uitkomsten van de HPLC en UV-bepalingen aanleiding om het optreden van ontleding tijdens de analyse te veronderstellen ?
Indien er sprake was van een aanzienlijke mate van ontleding dan zou bij de extinctiemeting de som van de medazepam en het ontledingsproduct bepaald zijn. Bij de HPLC-bepaling zou het ontledingsproduct zeer waarschijnlijk van de hoofdcomponent gescheiden zijn. Tenzij het ontledingsproduct zelf bij 253 geen lichtabsorptie zou vertonen (hetgeen gezien de structuur van medazepam niet aannemelijk lijkt) moet bij een aanzienlijke mate van ontleding de HPLC-bepaling significant lagere uitkomsten geven dan de UV-bepaling. Omdat daarvan gezien de uitkomsten geen sprake is, is het niet aannemelijk dat het lage gehalte van de capsules te wijten is aan ontleding tijdens de bereiding of de analyse.h. - Is er een analytische verklaring voor de afwijking tussen het gevonden gehalte en het gedeclareerde gehalte mogelijk ?
- Vormen de op deze wijze uitgevoerde HPLC-analyses een aanvaardbare manier om de uitkomsten van de UV-bepalingen te controleren en om uitsluitsel te geven over het werkelijke gehalte van de capsules ?
Uit de overeenstemming tussen de beide analysemethoden volgt, dat de gehalten in de oplossingen correct gemeten zijn. Bovendien volgt hieruit dat de UV-bepaling op de gebruikte apparatuur ondanks de hoge extinctiewaarden toch nog correcte resultaten geeft.
Het is echter niet uitgesloten dat de gemeten oplossingen niet correct gemaakt zijn: Mogelijkerwijze is bij de bereiding niet alle medazepam in oplossing gegaan (omschudden was wellicht niet toereikend voor een volledige extractie). Bovendien is het denkbaar dat bij het filtratieproces een deel van de medazepam aan het gebruikte filter geadsorbeerd is. Voor een onafhankelijk HPLC-onderzoek zouden de oplossingen opnieuw bereid moeten worden en zou de volledigheid van de extractie en het effect van de filtratie geverifiëerd moeten worden.
In een cetomacrogolcrème is 2% fenoxyethanol verwerkt.Vraag 3a. Geef aan op welke wijze deze stof uit deze matrix geïsoleerd (dus niet opgelost in een of andere oplosmiddelcombinatie !) zou kunnen worden, voorafgaande aan een HPLC-bepaling.
Voor deze isolatie komen de volgende methoden in aanmerking:
Methode 1. Verwarmen van de creme met een mengsel van methanol (70% tot 80%) en water, koelen, filtreren.
Methode 2. Verwarmen van de creme met vaste paraffine en een mengsel van methanol of ethanol (70 tot 80%) en water, koelen, filtreren.
Methode 3. Extractie van de crème met petroleumether en 70% methanol of ethanol.b. Beschrijf een gaschromatografische methode om de aanwezigheid van de crèmebestandelen cetostearylalcohol, cetiol en sorbitol aan te tonen.
De crème wordt verwarmd met een mengsel van azijnzuuranhydride en pyridine. Hierdoor worden de cetyl- en de stearylalcohol omgezet in hun acetaten, het sorbitol wordt omgezet in het hexa-acetaat. De cetiol blijft ongewijzigd. De volgorde van de pieken op het chromatogram is cetylacetaat, stearylacetaat, sorbitolhexa-acetaat, gevolgd door decyloleaat en enkele isomeren daarvan.c. Geef aan wat er bij de genoemde gaschromatografische analyse met het fenoxyethanol gebeurt.
Bij deze analysemethode wordt ook het fenoxyethanol geacetyleerd. Het ontstane fenoxyethylacetaat is ongetwijfeld gaschromatografisch aantoonbaar en zal vermoedelijk vóór de piek van het cetylacetaat geëlueerd worden.d. Welke pKa waarde verwacht u voor fenoxyethanol ?
De alcoholgroep is binnen het pHgebied van 0-14 niet merkbaar protoneerbaar of deprotoneerbaar. Eventuele pKa waarden liggen dus buiten dit gebied.e. Beredeneer welk van de onderstaande loopmiddelen voor de analyse van fenoxyethanol het zinvolst is:
Omdat fenoxyethanol niet protoneerbaar of deprotoneerbaar is binnen het pH-gebied van 0-14 is een toevoeging van perchloorzuur aan het loopmiddel overbodig.
- 40% methanol waaraan 10 mM perchloorzuur is toegevoegd, of
- 40% methanol
f. Is voor deze bepaling een Select-B kolom noodzakelijk of kan met een RP18 kolom volstaan worden ?
Het gebruik van Select-B is alleen noodzakelijk bij de chromatografie van basische verbindingen. In dit geval kan men met een RP18 kolom volstaan.
Volgens het onderstaand bereidingsvoorschrift is een infuusvloeistof bereid:a. Is het mogelijk om in dit infuus de kaliumionen aan te tonen met de in de bijlage beschreven series reacties ? Wat is de functie van de reactie met het natriumcarbonaat en het natriumsulfide ?
- calciumchloride (watervrij) 0,25 g
- kaliumchloride 0,2 g
- natriumchloride 8,6 g
- glucose (watervrij) 50 g
- gedestilleerd water tot 1000 ml
- Voor het analytisch onderzoek van dit infuus is een monster van 50 ml beschikbaar.
Volgens het voorschrift is 0,1 g van de betreffende grondstof nodig. Hiervoor zou 500 ml infuus tot een volumen van 2 ml gereduceerd moeten worden. Het is duidelijk dat zulks onmogelijk is.
Bovendien is de hier beschreven reactie kennelijk bedoeld voor grondstoffen, waarin hoogstens sporen verontreinigingen voorkomen.
De toevoeging van carbonaat en sulfide dienen om de aanwezigheid van andere ionen die met tartraat een neerslag zouden kunnen vormen uit te sluiten. De aanwezigheid van calciumionen in dit mengsel maakt dat deze reactie zoals beschreven voor dit infuus niet in aanmerking komt vanwege het neerslaan van calciumcarbonaat.b. Geef een methode om in dit infuus het gehalte aan calcium te bepalen.
De hoeveelheid calcium is in dit infuus te laag om een titrimetrische bepaling met edetaat mogelijk te maken. Als bepalingsmethode ligt dan A.A.S. voor de hand.c. Geef een methode om in dit infuus de identiteit van de calciumionen te bepalen.
De lichtabsorptie die bij A.A.S. in de vlam bij de meetgolflengte optreedt is niet alleen een selectieve gehaltebepaling, maar tevens een bevestiging van de identiteit.d. Geef een methode om in dit infuus het gehalte aan chloride te bepalen.
Voor de bepaling van chloride is de titratie met zilvernitraat de voor de hand liggende methode omdat de concentratie hiervan in het infuus toereikend is. Het eindpunt wordt bij voorkeur potentiometrisch (met een zilver-werkelectrode een 'double junction' zilver/zilverchloride referentie-electrode) vastgesteld. De titratie kan ook worden uitgevoerd met chromaationen als kleurindicator (titratie volgens Mohr). De chromaationen vormen met de eerste overmaat zilver een rood neerslag.
Chloride kan ook bepaald worden volgens Volhard. Hierbij wordt een overmaat zilvernitraat toegevoegd, waarna de overmaat zilver met thiocyanaat wordt teruggetitreerd (hierbij moet de reactie van thiocyanaat met het zilverchlorideneerslag worden verhinderd door dit neerslag te omhullen met dibutylftalaat). Het eindpunt wordt bij deze titratie vastgesteld met ferri-ionen, die met de eerste overmaat thiocyanaat een rood complex vormen.e. Geef een methode om in dit infuus de identiteit van de glucose te bepalen.
De identiteit wordt bij voorkeur bepaald door middel van dunnelaagchromatografie in combinatie met een voor suikers selectieve kleurreactie. Het aantonen van het reducerend vermogen door toevoegen van kopersulfaat gevolgd door natronloog en verwarmen van het aldus verkregen reactiemengsel is minder selectief, omdat deze reactie ook door andere open suikers (mannose, galactose, lactose, fructose e.d.) gegeven wordt.f. Geef een methode om in dit infuus het gehalte van de glucose te bepalen.
Het gehalte aan glucose wordt bepaald door middel van de optische rotatie. Bij gebruik van vers bereide oplossingen moet rekening met het optreden van mutarotatie worden gehouden. Aan de oplossing wordt dan een weinig ammonia (tot pH 10) toegevoegd en vervolgens wordt enige tijd (30 min.) gewacht voordat de meting uitgevoerd wordt.
2 november 2001
Staf Farmaceutische Analyse 5e-jaar