Uitwerking toets Analyse van Bereidingen 20 augustus 2001

Vraag 1

Een ziekenhuisapotheker laat 0,5 mg colchicine capsules bereiden volgens 2 verschillende methoden. Bij bereiding 1 wordt colchicine eerst opgelost in dichloormethaan. De oplossing wordt uitgegoten over microkristallijn cellulose en vervolgens drooggewreven. Bij bereiding 2 wordt de colchicine direct met microkristallijne cellulose gemengd. Om te onderzoeken welke bereidingsmethode beter is, wordt de gehaltespreiding bepaald op zes capsules uit beide charges. De resultaten van het onderzoek zijn hieronder gegeven en opgegeven voor zuivere colchicine. In het ziekenhuis is het gebruikelijk statistische uitspraken te doen met een betrouwbaarheid van 95%.

Tabel 1: Gehalte colchicine (mg/caps)

a. Een analist wil de waarde van de zesde capsule uit bereiding 2 verwerpen omdat de Q-test dit uitwijst. Bent u het eens met de beslissing dat deze waarde verworpen wordt?

Het is onjuist een Q-test toe te passen, wanneer een significante afwijking door andere oorzaken dan analysefouten veroorzaakt zou kunnen zijn. In dit geval ligt de oorzaak van de afwijking wellicht in een onvoldoende homogene verdeling.

b. Bereken of de spreidingen in het gehalte van beide bereidingen significant van elkaar verschillen.

Spreidingen in twee populaties kunnen door middel van een F-toets op significante verschillen onderzocht worden. Volgens de tabel is de kritische waarde voor de F-test (tweezijdig, 95% betrouwbaarheidsinterval bij 5 vrijheidsgraden voor de beide varianties) 7.15. De voor de F-test berekende waarde bedraagt 9,12, hetgeen groter is dan de kritische waarde volgens de tabel. De spreidingen verschillen dus significant.

c. Verklaar het eventueel gevonden verschil in gehaltespreiding tussen beide bereidingen.

Het is kennelijk moeilijk een kleine hoeveelheid colchicine homogeen te verdelen over de vulstof. Door gebruik te maken van een oplossing van colchicine wordt een betere verdeling bereikt.

d. Bereken of de gemiddelde gehalten significant van de gedeclareerde waarde verschillen.

Uit de in de bovenstaande tabel vermelde waarden blijkt dat het bij bereiding 1 vermelde gehalte significant afwijkt van het gedeclareerde gehalte. Bij bereiding 2 is de spreiding in het gehalte zo groot, dat er geen sprake is van een significante afwijking ten opzichte van het gedeclareerde gehalte.

e. Verklaar eventuele afwijkingen tussen het gevonden en gedeclareerde gehalte.

De grondstof mag volgens de monografie uit de Ph. Eur. 2 % water en 6% ethylacetaat bevatten. In het onderzoekslaboratorium wordt gemeten ten opzichte van zuivere colchicine. Bij de productie is de inweeg waarschijnlijk niet gecorrigeerd voor de aanwezigheid van oplosmiddelresiduen. Dit zou de afwijking van het gemiddelde gehalte ten opzichte van het gedeclareerde gehalte kunnen verklaren.

Vraag 2

a. Schat welke pKa-waarde(n) colchicine heeft.

De zuuramide functie heeft zeer zwak basische eigenschappen, de verwachten pK_a is lager dan 1.

b. Waarom wordt bij de gehaltebepaling van de grondstof een mengsel van tolueen en azijnzuuranhydride als oplosmiddel gebruikt?

De titratie met perchloorzuur in een medium van tolueen met azijnzuuranhydride wordt alleen bij zeer zwakke basen (zoals bij voorbeeld coffeïne) gebruikt. In ijsazijn is de potentiaalsprong te klein om het eindpunt van de titratie te kunnen vaststellen.

c. Leg uit of colchicine in dit preparaat d.m.v. een titratie te bepalen is, zoals dit voor de grondstof beschreven staat.

Voor deze titratie van colchicine is omstreeks 0,7 mmol nodig. De hoeveelheid in deze bereiding (ongeveer 1 micromol) is daartoe ontoereikend.

Vraag 3

a. Leg uit of het UV-spectrum van colchicine een pH-shift vertoont.

De zuuramidefunctie van colchicine maakt geen deel uit van het geconjugeerde systeem. Protonering en deprotonering hebben daarom geen effect op het UV-spectrum van colchicine.

b. In zuur of alkali kan colchicine omgezet worden naar colchiceïne (zie "impurities). Leg uit of het UV-spectrum van deze stof een pH-shift vertoont.

In colchiceïne is een hydroxylgroep aanwezig in het geconjugeerde systeem. Daardoor is bij deze verbinding wel een pH-shift te verwachten bij deprotonering in alkalisch milieu.

c. Beschrijf een optimale UV-gehaltebepaling van colchicine in deze capsules. Welke opwerking, welke meetconcentratie en welke golflengte gebruikt u?

Voor een extinctie van 0,5 bij 350 nm is een concentratie van 1.17 mg/100 ml nodig. De meting bij deze golflengte is selectiever dan die bij 242 nm.
De gehaltebepaling van colchicine met UV kan derhalve als volgt uitgevoerd worden:
Los de inhoud van 1 capsule voor zover mogelijk op in 50,0 ml methanol. Laat de onopgeloste delen (microkristallijne cellulose) bezinken, centrifugeer of filtreer zonodig, en meet de extinctie van de verkregen oplossing bij 350 nm. De verwachte extinctie bedraagt 0,43.

d. Moet u bij de UV-bepaling rekening houden met ontleding van colchicine? Zo ja, uit welk(e) gegeven(s) uit de monografie blijkt dit en hoe controleert u of de gehaltebepaling hierdoor beïnvloed wordt. De ontledingsproducten die eventueel onder invloed van licht kunnen ontstaan zijn de onzuiverheden C t/m E.

De verontreinigingen B tot en met E hebben een van colchicine afwijkend geconjugeerd systeem en op grond daarvan vermoedelijk afwijkende spectra en extincties. De aanwezigheid hiervan zou wellicht vast te stellen zijn door het UV-spectrum van de te onderzoeken oplossing te vergelijken met dat van zuivere colchicine. Indien de reactieproducten een veel lagere extinctie zouden hebben is het echter niet zeker of de aanwezigheid er van in de vorm van het spectrum zichtbaar is.
Op grond van de structuur ligt het voor de hand te verwachten, dat de ontledingsproducten met HPLC gescheiden kunnen worden van colchicine. Vergelijking van de uitkomst van de UV-bepaling met die van een HPLC-bepaling kan uitsluitsel geven over de vraag of aanwezige ontledingsproducten de UV-bepaling storen.
Uit de monografie blijkt uit de opmerking bij de test op related substances : "Carry out the test protected from bright light" en "prepare the solutions immedeately before use" dat colchicine in oplossing binnen korte tijd kan ontleden.

Vraag 4

a Hoe verifieert u of dit preparaat colchicine bevat?

Door extractie van enkele capsules met dichloormethaan of alcohol, gevolgd door droogdampen van het verkregen extract kan een IR-spectrum opgenomen worden. Het verdient aanbeveling hierbij ook de referentie colchicine op te lossen in het gebruikte oplosmiddel en de verkregen oplossing droog te dampen.
Daarnaast kan colchicine geidentificeerd worden met behulp van dunnelaagchromatografie met een daarvoor geschikt loopmiddel.

b. Moet een HPLC bepaling voor colchicine uitgevoerd worden met een neutraal, zuur of alkalisch loopmiddel, of maakt dit geen verschil?

Gezien de mogelijke ontleding in zuur milieu verdient een neutraal loopmiddel bestaande uit methanol en water (of acetonitril en water) op een reversed phase kolom de voorkeur.

c. Hoe bepaalt u de de identiteit van cellulose.

Microcristallijne cellulose kleurt niet met jodium maar wel met een oplossing van jodium en zinkchloride. Daarnaast kan microscopisch onderzoek (met gepolariseerd licht) aanwijzingen geven over de aanwezigheid van microkristallijne cellulose.
Ook het IR-spectrum geeft mogelijkheden voor identificatie.

d. Hoe bepaalt u of er nog resten dichloormethaan zijn achtergebleven in de capsules bij bereidingswijze 1.

Dit onderzoek kan naar analogie van het onderzoek op de aanwezigheid van chloroform in de grondstof met headspace gaschromatografische analyse geschieden. Indien deze technische mogelijkheden hiervoor ontbreken, kan de geur van het preparaat een indicatie voor de aan-/afwezigheid van dichloormethaan geven.

Vraag 5

Zinkoxide zetpillen 10 % (samenstelling zie bijlage)

a. Schets het vlekkenpatroon van de hulpstoffen van de zetpil er uit op een silicagel plaat met loopmiddel ethyleenchloride/ether 9:1 en detectie met ANS-reagens en benoem de vlekken.

Het bovenstaande chromatografische systeem scheidt op polaire groepen, maar niet op ketenlengte.
De bovenste vlek wordt veroorzaakt door de triglyceriden van adeps solidus en miglyol
Lager op het chromatogram bevinden zich twee vlekken waarvan de bovenste door 1,3-diglyceriden en de onderste door 1,2-diglyceriden veroorzaakt wordt. Vlak bij het opbrengpunt is mogelijkerwijze nog een vlek van monoglyceriden te zien.

b. Hoe kunt u de vetzuursamenstelling van de hulpstoffen van de zetpil analyseren?

De vetzuuranalyse geschiedt het eenvoudigst door de tri-, di- en monoglyceriden te behandelen met kaliumhydroxide in methanol. Hierbij treedt 'methanolyse' op en er ontstaan methylesters van de vetzuren. Deze kunnen na extractie met heptaan gaschromatografisch geanalyseerd worden. Dit geschiedt bij voorkeur op een voldoend polaire stationaire fase, waarop ook het onderscheid tussen verzadigde en onverzadigde vetzuren zichtbaar is of op een daarvoor geschikte capillaire kolom.

c. Hoe bepaalt u de identiteit van het zinkoxide? (vermeld bepalingsmethode en opwerking)

Door een deel van de zetpil te verbranden in een porceleinen kroes ontstaat een asrest die bij verhitting geel en na bekoelen wit gekleurd is. Na bekoelen kan deze asrest in verdund zoutzuur opgelost worden. Bij alkalisch maken met ammoniak ontstaat geen neerslag. Na toevoegen van natriumsulfideoplossing ontstaat een wit neerslag.
Een alternatief voor deze aantoning is het onderzoek van de zoutzure oplossing met AAS.

d. Hoe bepaalt u het gehalte van het zinkoxide? (vermeld bepalingsmethode en opwerking)

Het gehalte van zinkoxide wordt bepaald door de zetpil met verdund zoutzuur te verwarmen , na bekoelen hexamine toe te voegen en te titreren met natriumedetaat met xylenoloranje als indicator. Als alternatief kan de zoutzure oplossing na verwijdering van de vaste vetbestanddelen en verdunning onderzocht worden met AAS.
[Opmerking: het gehalte aan zinkoxide wordt in dit preparaat opgegeven in een % en niet zoals gebruikelijk als een gewichtshoeveelheid per zetpil. De reden hiervoor is dat zinkoxide een lokale werking vertoont.]

20 augustus 2001
Staf Farmaceutische Analyse 5e-jaar