1

Onderzoek naar identiteit en gehalte van bereidingen

Inhoud van dit bestand

In het navolgende overzicht worden ten behoeve van het Practicum Analyse van Bereidingen regels gegeven voor de uitvoering van de analyses op dit practicum. Daarnaast wordt een toelichting gegevens bij de richtlijnen van de Ph. Eur. 1999 (Europese Farmacopee 1999) en de USP Ed. 23 (United States Pharmacopeia 23^th Edition) voor de bepaling van de gewichtsspreiding en de gehaltespreiding.

Identiteitsonderzoek aan bereidingen

Onafhankelijke identificatiemethoden

Identificatie met IR-spectra.

Identificatie met chromatografische methoden

Identificatie aan de hand van_monografieën voor enkelvoudige stoffen

Conclusie identificatie

Gehaltebepaling in bereidingen

Bepaling van de gewichtsspreiding

De bepaling van het gemiddeld gehalte

De bepaling van het gehalte per doseereenheid

Uitvoering van de gehaltebepaling bij het Practicum Analyse van Bereidingen.

Zuiverheidsonderzoek_in_bereidingen

Doelstelling

Bij het analytisch onderzoek van bereidingen gaat het in eerste instantie om het vaststellen van de identiteit en het gehalte van de aanwezige bestanddelen in de te onderzoeken preparaten. Zuiverheidsonderzoek dient vooraf aan de grondstoffen waaruit het preparaat bereid wordt te geschieden.

Identiteitsonderzoek aan bereidingen

Bij het practicum Analyse van Bereidingen moet de identiteit van de werkzame stoffen en de conserveermiddelen ondubbelzinnig vastgesteld worden en de aanwezigheid van de hulpstoffen op zijn minst aannemelijk gemaakt worden.
Wanneer de gebruikte identificatiemethode specifiek is, dat wil zeggen uitsluitend door de aan te tonen stof gegeven wordt, mag men volstaan met één enkele identiteitsreactie. Zo is het bij voorbeeld mogelijk natrium met vlamemissiespectrometrie ondubbelzinnig aan te tonen (mits men let op de hoeveelheden en een spoor natriumverontreiniging niet als de aanwezigheid van een aanzienlijke hoeveelheid interpreteert).
Dergelijke specifieke reacties zijn echter heel zeldzaam. Meestal worden identiteitsreacties gebruikt waarvan de selectiviteit beperkt is.

Onafhankelijke identificatiemethoden

Als regel wordt op het Practicum Analyse van Bereidingen aangehouden, dat een stof met ten minste twee, voldoende selectieve en van elkaar onafhankelijke, identificatiemethoden moet worden aangetoond. Met van elkaar onafhankelijke methoden wordt hier bedoeld dat de uitkomst van de tweede identificatie niet bij voorbaat uit het resultaat van de eerste identificatie volgt.
Een positieve reactie met het reagens van Bouchardat (een oplossing van jodium met kaliumjodide in verdund zoutzuur)geeft dezelfde informatie als een positieve reactie met het reagens volgens Dragendorff (een oplossing van kaliumtetrajodobismutaat). Beide reagentia geven neerslagen met alkaloidachtige stoffen en derhalve met meer dan de helft van de farmacotherapeutisch toegepaste verbindingen. Wanneer een te identificeren stof een neerslag geeft met het reagens van Bouchardat, dan zal die stof dat naar alle waarschijnlijkheid dus ook doen met het reagens van Dragendorff.
Fenolen vormen blauw tot paars gekleurde complexen met ferrichloride, gekleurde azoverbindingen met diazoniumreagentia en, veelal, onoplosbare broomsubstitutieproducten.Het optreden van blauwkleuring met ferrichloride heeft daarom een voorspellende waarde voor het optreden van de beide andere genoemde reacties. Er is dus ook hier geen sprake van onafhankelijke methoden.
Dit illustreert dat men bij het zoeken naar combinaties van identiteitsreacties zich rekenschap moet geven van de selectiviteit er van.

Identificatie met IR-spectra.

Het IR-spectrum is in veel gevallen een zeer selectieve methode mits de te identificeren stof voldoende zuiver uit de matrix geïsoleerd kan worden. Er bestaan echter nauwverwante verbinden die hiermee moeilijk van elkaar te onderscheiden zijn. Dat het IR-spectrum van chloramfenicolpalmitaat en dat van chloramphenicolstearaat veel op elkaar lijken kan op voorhand voorspeld worden. Voor de identificatie van deze stoffen is chromatografie in een reversed phase systeem, (waarin op ketenlengte gescheiden wordt) dan ook een noodzakelijke aanvulling.
Er bestaat echter ook een risico dat voor een en dezelfde stof door verschillen in kristalstructuur (modificaties)verschillende spectra gevonden worden.
Wanneer de te identificeren stoffen in slechts in geringe hoeveelheden aanwezig zijn is het vaak moeilijk deze in voldoend zuivere vorm uit de matrix te isoleren.
Ook moet men er bedacht op zijn, dat bij de isolatie van basische stoffen veelal de vrije base verkregen wordt, terwijl deze stoffen in de spectrale verzamelingen meestal als de hydrochloride of andere zouten voorkomen. Soms bestaat de geïsoleerde base uit een stroperig of glasachtig residu, dat ongeschikt is voor het opnemen van een IR-spectrum. Het verdient daarom aanbeveling de geïsoleerde basen met een kleine hoeveelheid verdund zoutzuur droog te dampen. Bovendien bestaat het risico, dat na het indampen de te analyseren stof in een andere modificatie uitkristalliseert, waardoor afwijkende spectra verkregen worden.
Het is een kunstfout af te gaan op het percentage overeenstemming dat de software van de IR-spectrofotometer meent te moeten afleiden uit de vergelijking van het monsterspectrum en de beschikbare referentiespectra.
De enige correcte interpretatie is een zorgvuldige visuele vergelijking van het gehele spectrum van het monster en de desbetreffende referentiestof waarbij in het bijzonder aandacht besteed moet worden aan die delen van het spectrum waarin nauw verwante verbindingen afwijkende absorpties vertonen. Vergelijking met de spectra van dergelijke verwante verbindingen is dan ook noodzakelijk.

Identificatie met chromatografische methoden

Chromatografische identificatie berust op vergelijking van distributiecoëfficiënten. Hiervoor is bij dunnelaagchromatografie in beginsel alleen het gebied met Rf-waarden tussen 0,2 en 0,8 bruikbaar. Bij HPLC komen als regel alleen capaciteitsfactoren >1 in aanmerking. Om reden van tijdsbesparing wordt bij HPLC echter zelden gewerkt met capaciteitsfactoren boven 10.
Chromatografische methoden, waarbij de scheiding op verschillende mechanismen berust, vormen onafhankelijke identificatiemethoden.
De resultaten van dunnelaagchromatografie op kiezelgel en die van de reversed phase dunnelaagchromatografie op gesilaniseerd kiezelgel (of op met alkylsilylgroepen gemodificeerd silicagel) zijn onafhankelijk van elkaar omdat de eerste op interactie tussen polaire groepen en de tweede op een solvofoob effect berust. HPLC op een RP-18 kolom en dunnelaagchromatografie op gesilaniseerd kiezelgel (of op met alkylsilylgroepen gemodificeerd silicagel) berusten op het solvofobe effect en vormen daarom geen onafhankelijke methoden.
Studenten geven zich vaak onvoldoende rekenschap van het feit, dat het chromatografische proces en de daarop volgende detectiemethode in feite twee identificatiemethoden vormen. Dunnelaagchromatografie gevolgd door een voldoende selectieve detectiemethode kan daardoor een afdoende identificatie geven.
Fluorescentieuitdoving bij 254 nm, ontkleuring van permanganaat en het reagens van Dragendorff zijn voorbeelden van universele reagentia die weinig selectiviteit aan de chromatografische scheiding toevoegen.
Het spreekt van zelf, dat men zich bij de identificatie moet afvragen of er gangbare verbindingen met een nauwverwante structuur, waarvan het chromatografisch gedrag sterk met de te identificeren verbinding overeen komt, bestaan. Voorbeelden daarvan vindt men binnen groepen als de barbituurzuurderivaten (amobarbital/pentobarbital) of de corticosteroiden. Door literatuuronderzoek dient men dan vooraf na te gaan in hoeverre dergelijke verwante verbindingen in het gekozen systeem een verschillend gedrag vertonen

Identificatie aan de hand van monografieën voor enkelvoudige stoffen

Bij het gebruik van farmacopee-monografieën voor enkelvoudige stoffen moet men er rekening mee houden dat dergelijk monografieën een samenhangend geheel vormen en bedoeld zijn voor het onderzoek van een grondstof.
Bij toepassing van identiteitsreacties uit de monografie bij de analyse van een bereiding kunnen andere in het monster aanwezige werkzame bestanddelen en hulpstoffen deze storen, zodat hierdoor vals-negatieve of vals-positieve resultaten verkregen worden.
Bij het dunnelaagchromatografisch onderzoek naar verwante verbindingen wordt vaak gebruik gemaakt worden van niet selectieve detectiereagentia omdat men juist zo veel mogelijk van de aanwezige verontreinigingen zichtbaar wil maken. De detectie heeft in dat geval niet de bedoeling specificiteit toe te voegen aan het onderzoek en het is dan ook onjuist dergelijke detectiereagentia voor de identificatie te gebruiken.

Conclusie identificatie

In hoeverre de toegepaste identificatiemethoden selectief zijn en in hoeverre er verwante stoffen bestaan die een overeenkomstig gedrag vertonen kan alleen beoordeeld worden indien men zich rekenschap geeft van de selectiviteit van de reacties en van het bestaan van verwante verbindingen. Identificatie is onmogelijk zonder inzicht hierin.

Bepaling van de spreiding in het gewicht van de doseereenheden

De vraag naar de spreiding van het gewicht van de afzonderlijke doseereenheden kan worden beantwoord door de afzonderlijke eenheden te wegen en de spreiding in het gewicht te berekenen.
Bij capsules moet het gewicht van de lege capsule van het brutogewicht van de capsule worden afgetrokken. Bij verdeelde suspensies wordt het gewicht bepaald door het gewicht van het flesje van het brutogewicht af te trekken.
Wanneer de hoeveelheid van het werkzame bestanddeel groot is ten opzichte van dat van de hulpstoffen dan is de gelijkmatige verdeling van de werkzame stof over de hulpstoffen waarschijnlijk geen probleem en kan men volstaan met de beoordeling van de gewichtsspreiding en een bepaling van het gemiddeld gehalte. Wanneer de hoeveelheid werkzaam bestanddeel (zeer) klein is ten opzichte van de hoeveelheid hulpstoffen dan moet ernstig rekening gehouden worden met de mogelijkheid van een ongelijkmatige verdeling van het werkzame bestanddeel over de massa tijdens de bereiding. In dat geval moet in het eindproduct de gelijkmatigheid van dosering worden gecontroleerd.

De Ph. Eur. 1999 eist voor de bepaling van de gewichtsspreiding dat 20 eenheden gewogen worden. De toegestane spreiding varieert met de geneesmiddelvorm en het gewicht er van. De toegestane grenzen staan vermeld in tabel 2.9.5.-1
De USP Ed 23 eist voor een onderzoek van de gewichtsspreiding ten minste 30 eenheden en volgt hierbij dezelfde procedure en grenzen als voor de bepaling van de Content uniformity.
Verder is het een opvallend verschil, dat de Ph. Eur. 1999 ook gewichtsonderzoek eist bij 'coated and film-coated tablets' terwijl de USP hier expliciet Content uniformity voor schrijft.
Het lijkt logisch om bij de gewichtsspreiding dezelfde eisen te stellen als bij Uniformity of content, omdat de gewichtsspreiding en gehaltespreiding een vergelijkbare invloed hebben op de aan de patiënt toegediende therapeutische dosis. De door de USP geformuleerde eisen lijken in dit opzicht consequenter.

De bepaling van het gemiddeld gehalte

De bepaling van het gemiddeld gehalte is een methode waarbij met minimale analytische inspanning (er behoeft immers slechts 1 bepaling uitgevoerd te worden) uitsluitsel verkregen wordt over de vraag of de correcte hoeveelheid werkzaam bestanddeel in het preparaat verwerkt is.
Om het effect van een (mogelijk) ongelijkmatige verdeling van het werkzame bestanddeel over de massa op het gevonden gemiddeld gehalte uit te sluiten is het noodzakelijk om een groot aantal eenheden te homogeniseren. Dit grote aantal geeft tevens het voordeel dat er veel meer van de te bepalen stof beschikbaar is dan bij een gehaltebepaling per doseereenheid.
Een bepaling van het gemiddeld gehalte dient altijd gecombineerd te worden met een onderzoek naar de gewichtsspreiding, omdat het gehalte in de onderzochte portie omgerekend moet worden naar het gehalte van een doseereenheid van gemiddeld gewicht.
De USP Ed. 23 geeft in de afzonderlijke monografieën aan hoeveel doseereenheden van het desbetreffende preparaat voor de bepaling van het gemiddeld gehalte onderzocht moeten worden. Meestal wordt hierbij een aantal van tenminste 20,soms echter 10 eenheden of een aantal eenheden dat met een voorgeschreven hoeveelheid werkzame stof correspondeert.

De bepaling van het gehalte per doseereenheid

De USP Ed 23 schrijft Content uniformity onderzoek voor indien het gehalte aan werkzaam bestanddeel minder 50 mg en/of minder dan 50% van het doseergewicht bedraagt.
De Ph. Eur. 1999 vraagt in paragraaf 2.9.5 voor doseereenheden met een gewicht beneden de 40 mg uniformity of content onderzoek. In de monografieën voor de geneesmiddelvormen wordt een onderzoek naar de Uniformity of content geeist indien het gehalte aan werkzaam bestanddeel 2 mg en/of minder dan 2% bedraagt. Deze eis is opmerkelijk minder streng dan die van de USP en geeft waarschijnlijk onvoldoende garanties dat preparaten waarbij de massa tijdens de verdeling over de eenheden onvoldoende homogeen was ontdekt worden (persoonlijke mening Dr. O.A.G.J. van der Houwen).
Zowel de Ph. Eur. 1999 als de USP Ed. 23 eisen in eerste instantie een onderzoek van 10 doseereenheden. Afhankelijk van de uitkomst kan een nader onderzoek van nog 20 eenheden nodig zijn. Dit betekent dat bij dit type onderzoek met aantallen van 30 analyses rekening gehouden moet worden. Daarom mogen dergelijke analyses niet te bewerkelijk zijn. Bovendien moeten ze uitgevoerd kunnen worden met de hoeveelheid werkzaam bestanddeel die zich in één doseereenheid bevindt. Voor een bepaling van het gemiddeld gehalte daarentegen is een tien- tot twintigvoudige hoeveelheid beschikbaar. Het ligt daarom voor de hand, dat de USP Ed. 23 voor het Content uniformity onderzoek soms een andere methode gebruikt dan voor de gemiddeld gehaltebepaling (Assay).
Omdat de USP Ed. 23 zowel een Assay als een Content uniformity eist is het eveneens begrijpelijk dat voor het onderzoek per doseereenheid soms een bepalingmethode voorgeschreven wordt die efficiënter uit te voeren is, maar die wellicht een beperkte systematische afwijking vertoont ten opzichte van de uitkomst van de Assay. Uiteindelijk gaat het bij het Content uniformity onderzoek om het vaststellen van de spreiding in het gehalte en niet om de absolute juistheid er van. De USP Ed. 23 schrijft daarom dan ook in de algemene regels voor dat wanneer er voor Content uniformity en Assay verschillende analysemethoden gebruikt worden er ook een portie van het gehomogeniseerde mengmonster voor de Assay volgens de methode voor het Content uniformity onderzoek onderzocht moet worden. Indien de uitkomsten minder dan 3% verschillen behoeft geen correctie toegepast te worden. Indien de uitkomsten tussen de 3 en 10 % verschillen moet het bij het Content uniformity onderzoek gevonden gehalte naar rato gecorrigeerd worden. Bij een verschil groter dan 10% is een aanpassing van de methode voor het Content uniformity onderzoek onvermijdelijk.
Indien de bepaling van het gemiddeld gehalte en het onderzoek per doseereenheid met dezelfde analysemethode worden uitgevoerd is het in beginsel mogelijk om het gemiddeld gehalte per gemiddeld doseergewicht te berekenen als het gemiddelde van de gehalten gevonden bij het onderzoek per doseereenheid.

Zowel de Ph. Eur. 1999 als de USP Ed 23 stellen grenzen van respectievelijk 15.0 en 25.0% bij het onderzoek naar de gelijkmatigheid van het gehalte. De USP Ed 23 stelt bovendien eisen aan de relatieve standaarddeviatie.
Er is echter nog een ander een belangrijk verschil. De Ph.Eur. 1999 beoordeelt de gehaltespreiding ten opzichte van het gevonden gemiddeld gehalte. De USP vergelijkt het gevonden gehalte met het gedeclareerde gehalte (label claim).
Deze wijze van beoordelen heeft consequenties voor die preparaten waarvan het gehalte betrekkelijk snel terug loopt en die met een hoger gehalte (dan de declaratie aangeeft) bereid worden. Dergelijke preparaten zouden bij keuring volgens de USP normen een onevenredig grote kans op afkeuring lopen (bij de beoordeling volgens de Ph. Eur. 1999 waarbij het gemiddelde gehalte per doseereenheid als norm is daarvan geen sprake). Om die reden laat de USP Ed 23 in dergelijke gevallen de spreiding berekenen ten opzichte van een gecorrigeerde waarde van het gedeclareerd gehalte. De USP omschrijft deze preparaten als preparaten waarbij het gemiddelde van de onder en de bovengrens hoger is dan 100% van de gedeclareerde waarde.

Uitvoering van de gehaltebepaling bij het Practicum Analyse van Bereidingen.

Bij het Practicum Analyse van Bereidingen ligt het accent op het kiezen van de correcte analysemethode en niet op het veelvuldig herhalen er van.
Bij alle monsters die in doseereenheden verdeeld zijn moet de gewichtsspreiding gecontroleerd worden.
Bij de bepaling van het gemiddeld gehalte moet deze bepaling ten minste in duplo uitgevoerd te worden. Dit heeft niet tot doel om de 'statistische betrouwbaarheid van het gemiddelde op te voeren', maar het dient als controle op eventuele blunders als afleesfouten bij het afwegen of vergissingen bij de keuze van de pipetten en maatkolven. Een duplo moet daarom een volledig bepaling zijn en niet (bij voorbeeld) een tweede injectie van het zelfde monster in de gaschromatograaf. Bij een te grote spreiding moet eerst nagegaan worden of voor de verschillen een verklaring gevonden kan worden, zo niet, dan moet nog een derde bepaling gedaan worden. De Dixons's Q-test kan eventueel uitsluitsel brengen of een van de uitkomsten verworpen moet worden.
Bij in doseereenheden verdeelde preparaten moeten voor het maken van een mengmonster ten minste zes eenheden gehomogeniseerd worden. Dit (in vergelijking met de farmacopee-eisen zeer lage)aantal is gekozen om het verbruik aan monsters op het practicum te beperken. In die gevallen waarin Uniformity of content vereist is worden niet meer dan 6 analyses verricht. Dit (in vergelijking met de farmacopee eisen zeer lage)aantal is gekozen om voor het onderwijs zinloze herhaling te voorkomen.
Voor zetpillen wordt altijd de Uniformity of content onderzocht. Hiervoor zijn twee redenen aan te geven. In de eerste plaats is het risico van niet homogene verdeling bij zetpillen betrekkelijk groot. In de tweede plaats is het maken van een homogeen mengmonster een technisch niet te verwaarlozen probleem. De vaak voorgestelde methode van het smelten van een reeks eenhedenen en het omroeren van de gesmolten massa is vanwege het risico van uitzakken van de onopgeloste stof vaak een remedie die erger is dan de kwaal.
Ten overvloede wordt er hier nog eens op gewezen dat bij een serie analyses voor een Uniformity of content onderzoek nooit !! een Q-test toegepast mag worden omdat er hier sprake is van analyses aan verschillende monsters !!
Omdat uniformity of content bedoeld is om inhomogeniteit in de massa uit te sluiten is het zinloos om dergelijke onderzoek te doen bij verdeelde oplossingen.

De bovenstaande beperkingen in de aantallen te onderzoeken monsters en te verrichten analyses maken het onmogelijk volgens farmacopee-normen goed-, dan wel af te keuren. Dit is echter geen probleem om dat deze problematiek later uitgebreid bij de Cursus Kwaliteisbeheer aan de orde komt.

Bij gehaltebepalingen in bereidingen kunnen systematische fouten optreden door verliezen bij voorzuiveringen (zoals extracties of uitsmelten). Dergelijke storingen kan men achterhalen door een proefmengsel op overeenkomstige wijze te analyseren. Omdat de omvang van de storingen over het algemeen niet zeer reproduceerbaar is, moet het als een kunstfout beschouwd worden, wanneer de uitkomst van de analyse van het proefmengsel als correctiefactor voor de berekening van het gehalte van het te onderzoeken monster gebruikt wordt.

De farmacopeeën gaan uit van een aselecte steekproef uit de gehele partij. In de praktijk kan een selecte steekproef gewenst zijn b.v. bij het valideren van een bereidingsmethode.
Voor capsules worden in dat geval monsters genomen uit het midden en de hoekpunten van het capsuleerapparaat, bij zetpillen worden de eerste en laatste (niet verworpen)zetpillen getest. Indien tijdens de bereiding een filtratie uitgevoerd wordt, zijn de eerste niet verworpen preparaten het meest interessant om op gehalte te onderzoeken.
De monsters voor het AB practicum zijn altijd aselect getrokken uit de bestaande voorraad, zodat onderzoek volgens bovenstaande methodes niet mogelijk is.

Zuiverheidsonderzoek in bereidingen

In de British Pharmacopoeia 1999 en de United States Pharmacopeia Ed 23. worden bij bereidingen vaak zuiverheidstesten vermeld die analoog zijn aan die welke op de grondstof verricht worden. Het verdient echter de voorkeur dergelijke testen op de te gebruiken grondstof zelf te verrichten en niet op het bereide preparaat.
Dit geld uiteraard niet voor testen op verontreinigingen die door ontleding van de betreffende grondstoffen zouden kunnen ontstaan. Voorbeelden hiervan zijn hydrazine in een isoniazidedrank of salicylzuur in acetylsalicylzuurbereidingen

Farmaceutische Analyse 5e-jaar |

22 februari 2001