Inhoudsopgave
Bij het onderzoek van bereidingen is isolatie van de te analyseren bestanddelen noodzakelijk indien de begeleidende stoffen de toe te passen analyse storen of wanneer de concentratie van het te bepalen bestanddeel niet toereikend is voor de te gebruiken analysemethode.
Hiervoor wordt dikwijls gebruik gemaakt van één van de onderstaande technieken
Droge extractie is gebaseerd op verschillen in oplosbaarheid. Door gebruik van het juiste oplosmiddel kan de werkzame stof van de overige bestanddelen gescheiden worden.
Gegevens over de oplosbaarheid kunnen in de literatuur worden gevonden. Belangrijke bronnen zijn de Pharmacopoeia Europea (onder Characters), de Merck Index en Clarke's Isolation and Identification of Drugs.
Binnen het vakgebied van de farmacie zijn de volgende aanduidingen van de oplosbaarheid gebruikelijk. Let er op dat de hoeveelheid oplosmiddel in g gedefinieerd wordt.
|
engelse omschrijving |
1 g lost op in |
nederlandse omschrijving |
|
very soluble |
minder dan 1 g |
zeer gemakkelijk oplosbaar |
|
freely soluble |
tussen 1 tot 10 g |
gemakkelijk oplosbaar |
|
soluble |
tussen 10 tot 30 g |
oplosbaar |
|
sparingly soluble |
tussen 30 tot 100 g |
weinig oplosbaar |
|
slightly soluble |
tussen 100 tot 1000 g |
moeilijk oplosbaar |
|
very slightly soluble |
tussen 1000 tot 10 000 g |
zeer moeilijk oplosbaar |
|
practically insoluble |
meer dan 10 000 g |
nagenoeg onoplosbaar |
Bij tabletten en capsules kunnen de werkzame bestanddelen vaak geïsoleerd worden door extractie met een organisch oplosmiddel als aceton. Deze methode wordt door het onderstaande voorbeeld geïllustreerd.
Paracetamol Tablets (BP 2000)Bij suppositoria en zalven kan het werkzame bestanddeel soms geïsoleerd worden door ontvetten met petroleumether zoals beschreven wordt in het voorschrift voor bisacodylzetpillen:
Identification Extract a quantity of the powdered tablets containing 0.5 g of Paracetamol with 20 ml of acetone, filter, evaporate the filtrate to dryness and dry at 105�. The residue complies with the following tests.....
Bisacodyl suppositories (BP 2000)Bij het toepassen van droge extracties moet men er rekening mee houden, dat bij de isolatie van kleine hoeveelheden onoplosbare stoffen gemakkelijk aanzienlijke 'mechanische' verliezen kunnen optreden. In dergelijke gevallen geeft een tweefasische extractie vaak betrouwbaarder resultaten.
Identification B. Dissolve a quantity of the suppositories containing 0.15 g of Bisacodyl as completely as possible in 150 ml of petroleum spirit (boiling range, 40� to 60�), filter, wash the residue with petroleum spirit (boiling range, 40� to 60�) until free from fatty material and dry at about 100�.......Chloramphenicol Eye Ointment) (BP 2000
Identification: Mix a quantity containing 30 mg of Chloramphenicol with 10 ml of petroleum spirit (boiling range, 40� to 60�), centrifuge and discard the supernatant liquid. Repeat this procedure using three 10-ml quantities of the same solvent. The dried residue complies with the following tests.
Vluchtige bestanddelen kunnen door destillatie of stoomdestillatie uit een bereiding geïsoleerd worden. Bij gebruik van de correcte apparatuur kan tijdens het destillatieproces door het volgen van de temperatuur een aanwijziging omtrent grotere hoeveelheden aanwezige bestanddelen verkregen worden. Kleinere hoeveelheden kunnen op deze manier niet opgespoord worden. Ze zijn echter wel met daarvoor geschikte methoden in het destillaat aan te tonen of kwantitatief te bepalen.
Omdat destillatie op vluchtigheid berust kunnen stoffen die via destillatie geïsoleerd kunnen worden vaak op eenvoudiger wijze gaschromatografisch aangetoond worden.
Voor kwalitatieve doeleinden kan men vluchtige stoffen vanuit een microschaaltje op een koelbolletje opvangen. De opgevangen druppel met de vluchtige stoffen kan dan vervolgens verder onderzocht worden. Op deze wijze kan men bij voorbeeld alcohol of azijnzuur in complexe preparaten aantonen, wanneer men die vanwege de overige bestanddelen niet als zodanig op de gaschromatografische kolom zou willen injecteren.
Een aantal stoffen kan bij verwarming direct vanuit de vaste stof in dampvorm overgaan. In contact met een koud voorwerp slaan dergelijke stoffen in kristallijne vorm daarop neer. Zwavel, jodium, kamfer, coffeine, sorbinezuur en benzoezuur zijn enkele willekeurig gekozen voorbeelden van dergelijke stoffen. Indien een monster dat dergelijke stoffen bevat in een reageerbuis voorzichtig verwarmd wordt, dan ziet men de betreffende stoffen vaak in het koude gedeelte van de reageerbuis in kristallijne vorm neerslaan.
In suspensies kunnen de onopgeloste gesuspendeerde stoffen vaak door centrifugeren en uitwassen in zuivere vorm verkregen worden. De British Pharmacopoeia 2000 maakt van deze methode gebruik bij het onderzoek van Methylprednisolone acetate injection.
Methylprednisolone acetate injection (BP 2000)Zuren en basen kunnen vanuit de geladen oplosbare vorm vaak door pH-verandering in de onoplosbare vorm omgezet worden. Deze kan dan vervolgens door centrifugeren en wassen gezuiverd worden.
Identification Dilute a volume containing 0.1 g of Methylprednisolone Acetate to 5 ml with water, centrifuge and discard the supernatant liquid. Wash the residue with five 5-ml quantities of water, resuspending the residue in the water each time, centrifuging and discarding the washings. The residue, after drying at 105� for 3 hours, complies with the following tests.
A. The infrared absorption spectrum, Appendix II A, is concordant with the reference spectrum of methylprednisolone acetate (RS 226).
B. Complies with the test for identification of steroids, Appendix III A, using impregnating solvent I and mobile phase A.
Sommige anorganische bestanddelen kunnen uit complexe matrices door gloeien geïsoleerd worden. Een voorbeeld hiervan zijn de identificatie, respectievelijk de gehaltebepaling van zinkoxide in het onderstaande preparaten:
Zinc and Salicylic Acid Paste (BP 2000)Bij alkalimetalen blijft na het gloeien het residu soms als een onzichtbare film achter. De aanwezigheid kan dan door middel van een duidelijk alkalische reactie met behulp van een indicator als lakmoes worden vastgesteld.
Zinc Oxide, finely sifted 240 g
Salicylic Acid, finely sifted 20 g
Starch, finely sifted 240 g
White Soft Paraffin 500 g
Identification B: Heat 0.5 g gently in a porcelain dish over a very small flame until the basis is completely volatilised or charred. Increase the heat until all the carbon is removed. The residue is yellow when hot and white when cool.
Assay: For zinc oxide To the combined aqueous extracts obtained in the Assay for salicylic acid add 20 ml of 1M sodium hydroxide and 50 mg of xylenol orange triturate. To the resulting solution add sufficient hexamine to change the colour of the solution to red and then a further 3 g of hexamine and titrate with 0.1M disodium edetate VS. Each ml of 0.1M disodium edetate VS is equivalent to 8.139 mg of ZnO.Calamine Ointment (BP 2000)
Definition Calamine is a basic zinc carbonate suitably coloured with iron(III) oxide.
Assay Gently heat 1 g until the basis is completely volatilised or charred, increase the heat until all the carbon is removed and ignite the residue until, after further ignition, two successive weighings do not differ by more than 0.2% of the weight of the residue. Each g of residue is equivalent to 0.8034 g of Zn.
Tweefasische extractie is de meest gebruikte clean-upmethode. Het is echter ook de ingewikkeldste. Dit wordt veroorzaakt door het grote aantal gebruikte fasencombinaties, door het effect van de pH op de extractie van protoneerbare stoffen met zuur, basisch of amfoteer karakter en door de mogelijkheid van ionpaarvorming.
Scheidingen met behulp van tweefasische extracties berusten op verschillen in verdelingscoëfficiënten van de te scheiden stoffen in een systeem van twee niet met elkaar mengbare fasen. Een systeem van twee niet met elkaar mengbare fasen bestaat per definitie uit een combinatie van een polaire met een apolaire fase. De ligging van het verdelingsevenwicht over deze twee fasen wordt bepaald door de verdelingscoëfficiënt (P) en de fasen-volumen verhouding (FV). De verdelingscoëfficiënt is gedefinieerd als de concentratie in de apolaire fase gedeeld door die in de polaire fase.
Het extractiemechanisme en de rol van de beide fasen
De hoogte van de verdelingscoëfficiënt is bij een gegeven stof afhankelijk van de gebruikte fasencombinatie. Het mechanisme van het verdelingsproces berust op een combinatie van solvofobe effecten in de polaire fase, waardoor de te analyseren stof als het ware wordt 'uitgedreven' naar de apolaire fase en het bevorderen van de overgang van de te analyseren stof naar de apolaire fase door interacties tussen de te analyseren stof en de apolaire fase.
Tot op zekere hoogte kunnen de apolaire fase en de polaire fase onafhankelijk van elkaar gekozen worden, mits voldaan is aan de eis, dat ze niet mengbaar zijn.
Hoe groter het solvofobe effect in de polaire fase is, des te hoger zal de verdelingscoëfficiënt van de te analyseren stof zijn. Gebruik van water als polaire fase geeft de hoogste verdelingscoëfficiënten. Door de toevoeging van 'modifiers' als methanol, ethanol, acetonitril e.a. wordt de samenhang tussen de watermoleculen sterk verminderd. Hierdoor neemt het hydrofobe effect af. Dit mechanisme is identiek aan het retentiemechanisme bij reversed phase adsorptiechromatografie.
Hoe groter de interacties met de apolaire fase zijn, des te hoger valt de verdelingcoëfficiënt uit. Om deze reden zijn ether en chloroform effectievere extractiemiddelen dan petroleumether.
Omdat diethylether in tegenstelling tot chloroform waterstofbruggen kan vormen met zuren geeft ether voor zuren extra hoge verdelingscoëfficienten. Salicylzuur heeft bij voorbeeld in een systeem chloroform/water een verdelingscoëfficient van omstreeks 20, terwijl in een systeem ether/water de verdelingscoëfficiënt omstreeks 120 bedraagt.
Voor basische stoffen, die juist sterkere interacties vertonen met chloroform (chloroform is immers een donor bij de vorming van waterstofbruggen) geldt het omgekeerde. Voor een stof als kinine geldt dat de verdelingscoëfficiënt in chloroform/water ongeveer 10x groter is dan die in het systeem ether/water.
Systemen met minimale verdelingscoëfficiënt
Voor de isolatie van geneesmiddelen uit vette matrices gebruiken we bij voorkeur systemen waarin de vette hulpstoffen naar de apolaire fase gaan en de minder apolaire geneesmiddelen naar de polaire fase. Om dat te bereiken moeten dergelijke systemen minimale verdelingscoëfficiënten geven voor de te isoleren geneesmiddelen.
Model voor dergelijke systemen staat de klassieke combinatie van petroleumether met 70% ethanol. In de moderne farmacopeeën vindt men echter vaker andere combinaties.
Als alkanen worden in plaats van petroleumether ook trimethylpentaan, hexaan, heptaan of cyclohexaan gebruikt. In plaats van de 70% alcohol worden ook andere percentages en combinaties van water met 'modifiers' als methanol, acetonitril, azijnzuur of zelfs dimethylsulfoxide toegepast.
Hyrocortisone Acetate Cream (BP 2000)Dergelijke systemen zijn verwant met de cleanupmethoden waarbij het monster wordt uitgesmolten met een water-modifiermengsel. Hierbij fungeren de gesmolten, in de polaire fase onoplosbare, vetten feitelijk als de apolaire fase.
Identification (TLC)
For creams containing more than 0.5% w/w of Hydrocortisone Acetate, prepare two solutions in the following manner.
For solution (1) mix a quantity of the cream containing 25 mg of Hydrocortisone Acetate with 10 ml of methanol (90%), add 50 ml of hot hexane and shake.
Discard the upper layer, add 5 g of anhydrous sodium sulphate to the lower layer, mix and filter through a glass microfibre filter (Whatman GF/C is suitable).Fluocinonide Ointment (BP 2000)
Assay Carry out the method for liquid chromatography, Appendix III D, using the following solutions. For solution (1) disperse a quantity of the ointment containing 1.5 mg of Fluocinonide in 20 ml of methanol (80%) in a 100-ml separating funnel containing 50 ml of 2,2,4-tri-methylpentane. Warm the contents over a water bath and shake gently for 2 minutes. Allow the layers to separate and transfer the lower layer to a 50-ml flask. Repeat the extraction with a further 20 ml of methanol (80%). Dilute the combined extracts to 50 ml with the same solvent.RRR-Alpha Tocopheryl Hydrogen Succinate (BP 2000)
Test solution (b). In a ground glass-stoppered tube, dissolve 10 mg of the substance to be examined in 2 ml of 2.5M alcoholic sulphuric acid. Heat on a water bath for 5 min. Cool and add 2 ml of water R and 2 ml of cyclohexane R. Shake for 1 min. Use the upper layer.Light Liquid Paraffin Eye Drops (BP 2000)
Polycyclic aromatic hydrocarbons Use reagents for spectrophotometry. Place 25 ml of the eye drops into a 125-ml separating funnel with unlubricated ground-glass parts (stopper, stopcock) and add 25 ml of hexane previously shaken twice with one-fifth its volume of dimethyl sulphoxide. Shake the solution vigorously with 5 ml of dimethyl sulphoxide for 1 minute, allow to stand until two clear layers are produced and transfer the lower layer to a second separating funnel, add 2 ml of hexane and shake the mixture vigorously. Allow to stand until two clear layers are produced and separate the lower layer (solution A). Measure the light absorption in the range 260 nm to 420 nm, Appendix II B, using in the reference cell the clear lower layer obtained by vigorously shaking 5 ml of dimethyl sulphoxide with 25 ml of hexane for 1 minute. Measure the absorbance of a solution containing 7.0 �g per ml of naphthalene in 2,2,4-trimethylpentane at the maximum at 275 nm, Appendix II B, using 2,2,4-trimethylpentane in the reference cell.Fluocortolone Cream (BP 2000)
Definition Fluocortolone Cream contains Fluocortolone Pivalate and Fluocortolone Hexanoate in a suitable basis.
For solution (2) add 20 ml of a mixture of 4 volumes of acetonitrile and 1 volume of water followed by 50 ml of 2,2,4-trimethylpentane to a quantity of the preparation being examined containing 2 mg of Fluocortolone Pivalate and heat on a water bath, shaking intermittently, until the preparation is completely dispersed. Remove from the water bath, shake vigorously for 3 minutes, allow to separate and transfer the lower, aqueous acetonitrile layer to a flask. Repeat the extraction of the 2,2,4-trimethylpentane solution with a further 20 ml of the acetonitrile-water mixture and again transfer the lower, aqueous acetonitrile layer to the flask. Dilute the combined extracts to 50 ml with a mixture of 4 volumes of acetonitrile and 1 volume of water and filter a portion using a pressure filter (a Swinnex filter holder prepared with a double thickness of Whatman No. 42 filter paper is suitable).
Diflucortolone Oily Cream (BP 2000)Indien de vetfase na het uitsmelten en bekoelen verwijderd moet worden is het soms aan te bevelen bij het uitsmelten een hoeveelheid vaste paraffine toe te voegen. Hierdoor wordt het stolpunt van het vet verhoogd en is het gemakkelijker de gestolde vetfase te verwijderen.
Assay Carry out the method for liquid chromatography.
For solution (2) add 40 ml of methanol to a quantity of the cream containing 1 mg of Diflucortolone Valerate, disperse by heating on a water bath at 60� for 5 minutes and shake for 30 seconds. Add 10 ml of water, cool in ice for 10 minutes and filter.Metronidazole Suppositories (BP 2000)
Assay Weigh five suppositories, melt together by warming and allow to cool, stirring continuously until the mass is set. To a quantity containing 0.5 g of Metronidazole add 60 ml of anhydrous acetic acid, previously neutralised to 1-naphtholbenzein solution with 0.1M perchloric acid VS, warm at 30� for 30 minutes and shake for 5 minutes. Cool and carry out Method I for non-aqueous titration, Appendix VIII A, using 1-naphtholbenzein solution as indicator. Each ml of 0.1M perchloric acid VS is equivalent to 17.12 mg of C6H9N3O3 .Flurbiprofen Suppositories (BP 2000)
Identification: A. Carry out the method for thin-layer chromatography. For solution (1) cut a suitable number of the suppositories into small pieces, add 50 ml of methanol to a quantity containing 0.1 g of Flurbiprofen, heat gently until melted, shake mechanically for 10 minutes, allow to cool at 2� to 8�, filter (Whatman No. 1 paper is suitable) and evaporate to dryness. Dissolve the residue in 5 ml of a mixture of equal volumes of methanol and water.
Systemen met maximale verdelingscoëfficiënt
Bij isolatie uit polaire matrices moeten de geneesmiddelen overgaan naar de apolaire fase, terwijl de polaire hulpstoffen in de polaire fase achterblijven. In dergelijke systemen moet de verdelingscoëfficiënt juist zo hoog mogelijk zijn. Dit wordt bereikt door water als polaire fase te gebruiken. De apolaire fase dient zo polair mogelijk gekozen te worden. (Voorwaarde is hierbij echter, dat de apolaire fase niet zo polair gekozen wordt, dat deze mengbaar is met water). In de praktijk worden meestal ether/water of chloroform/water gebruikt. Vanwege de toxiciteit van chloroform wordt in plaats hiervan in recente monografieën steeds vaker dichloormethaan voorgeschreven. Het gebruik van andere extractiemiddelen zoals tolueen, tetrachloorkoolstof of ethylacetaat komt slechts sporadisch voor.
Aspirin and Caffeine Tablets (BP 2000)Extractie van zuren, basen en amfotere stoffen.
Definition: Aspirin and Caffeine Tablets contain, in each, 350 mg of Aspirin and 30 mg of Caffeine.
Identification B. Shake 0.5 g of the powdered tablets with 10 ml of water for 5 minutes, filter and add 10 ml of 1M sodium hydroxide. Extract with three 30-ml quantities of chloroform, washing each extract with the same 10 ml of water. Filter the combined extracts through absorbent cotton and evaporate the filtrate to dryness. Reserve a quantity of the residue for test C. Dissolve 10 mg of the residue in 1 ml of hydrochloric acid, add 0.1 g of potassium chlorate and evaporate to dryness in a porcelain dish. A reddish residue remains which becomes purple on exposure to ammonia vapour.Chloramphenicol Capsules (BP 2000)
Definition: Chloramphenicol Capsules contain Chloramphenicol.
Identification: Suspend a quantity of the contents of the capsules containing 0.1 g of Chloramphenicol in 60 ml of water and extract with two 20-ml quantities of petroleum spirit (boiling range, 120� to 160�). Wash the combined extracts with two 15-ml quantities of water, add the washings to the aqueous layer, extract with four 50-ml quantities of ether and evaporate the combined ether extracts. The residue complies with the following tests....Hydrocortisone Acetate Injection (BP 2000)
Definition: Hydrocortisone Acetate Injection is a sterile suspension of Hydrocortisone Acetate in Water for Injections
Assay To a quantity containing 50 mg of Hydrocortisone Acetate add 20 ml of water and extract with three 30-ml quantities of chloroform. Filter the extracts through absorbent cotton and add sufficient chloroform to produce 100 ml. Dilute 10 ml to 50 ml with chloroform, transfer 4 ml of the resulting solution to a 25-ml graduated flask and remove the chloroform in a current of air. Dissolve the residue in 10 ml of aldehyde-free ethanol (96%) and complete the tetrazolium assay of steroids.
Bij de analyse van stoffen die betrokken zijn bij protolytische reacties is het gedrag bij extracties afhankelijk van de mate van protonering. Als vuistregel kan men aanhouden dat dergelijke stoffen alleen in de ongeladen vorm geëxtraheerd kunnen worden. Indien men de extractieopbrengst (EF) tegen de pH uitzet ontstaat een sigmoïdale curve.
Voor zwakke zuren, waarvan de geprotoneerde vorm ongeladen is wordt deze extraheerbaarheidscurve gegeven door de vergelijking
EF = P � FV / ( P � FV + 1 + 10 pH - pKa )
Hierin stelt EF de geëxtraheerde fractie, P de verdelingscoëfficiënt en FV de fasenvolumenverhouding voor. Het buigpunt van deze curve valt niet samen met de pKa. De ligging van het buigpunt wordt gegeven door de formule:
pH = pKa + log( P � FV + 1)
De onderstaande afbeelding illustreert dit.
Voor zwakke basen, waarvan de gedeprotoneerde vorm ongeladen is wordt de extraheerbaarheidscurve gegeven door de vergelijking.
EF = P � FV / ( P � FV + 1 + 10 pKa - pH )
Hierin stelt EF de geëxtraheerde fractie, P de verdelingscoëfficiënt en FV de fasenvolumenverhouding voor.
Ook hier valt het buigpunt van de curve niet samen met de pKa, het verschuift hier naar lagere pH-waarden. Voor de ligging ervan geldt de formule
pH = pKa - log ( P � FV + 1 )
De onderstaande afbeelding illustreert dit:
Extractie van amfotere stoffen
Voor amfotere stoffen, waarvan de zure functie een hogere pKa-waarde (pKaz) heeft dan de basische functie (pKab) wordt de extraheerbaarheidscurve gegeven door de vergelijking:
P � FV / ( 1 + P � FV + 10 pH - pKaz + 10 pKb - pH )
Voor deze stoffen geldt dat de zowel de ligging van het buigpunt behorend bij de zure functie als die behorend bij de basische functie verschuift.
pH = pKaz + log ( P � FV + 1 )
pH = pKab - log ( P � FV + 1 )
De onderstaande figuur illustreert de extractiecurve van een amfotere stof.
Indien de pKa-waarde van de zure functie lager is dan die van de basische functie, dan ontstaat tussen de beide pKa-waarden een 'zwitterion', dat meestal te polair is om geëxtraheerd te worden.
Keuze van de geschikte pH voor de extractie
Indien men bij de extracties van zure of basische stoffen de maximale of minimale extraheerbaarheid wil bereiken moet men de pH zodanig instellen dat deze meer dan twee eenheden van het buigpunt in de extraheerbaarheidscurve verwijderd is. Omdat de verdelingscoëfficiënten in de praktijk vrijwel nooit bekend zijn moet men hierbij zeer ruime marges aannemen. Daarom extraheert men zure stoffen over het algemeen bij pH 1 of lager.
Dergelijke extracties worden bij voorkeur uit 0,05 M zwavelzuur uitgevoerd. Bij gebruik van zoutzuur en chloroform als extractiemiddel kunnen soms complicaties optreden door de extractie van de geprotoneerde base in combinatie met chloride als ionpaar.
Bij basische stoffen extraheert men meestal bij pH 13 of hoger.
Amfotere stoffen extraheert men bij de pH die tussen de beide pKa-waarden in ligt.
Bij basische stoffen met esterfuncties dient men er op bedacht te zijn, dat tijdens de extractiewerkzaamheden bij hoge pH gemakkelijk hydrolyse optreedt. Men dient de extracties dan zeer snel uit te voeren om de blootstelling aan de sterk alkalische oplossing zo veel mogelijk te beperken. In sommige gevallen kan men ook overwegen bij een iets lagere pH te extraheren. Dit kan door het gebruik van zwakkere basen als ammonia of natriumwaterstofcarbonaat.
Atropine Eye Ointment (BP 2000)Door de extractie uit zuur milieu vooraf te laten gaan door een extractie uit alkalisch milieu worden eventuele verontreinigingen, die zowel uit zuur als uit alkalisch milieu extraheerbaar zijn verwijderd voorafgaande aan de isolatie van de te analyseren stof. Het navolgende analysevoorschrift voor een fenobarbitaldrank illustreert dit:
Identification:A. Complies with test A for Identification described under Atropine Injection but preparing solution (1) in the following manner. Dissolve a quantity of the ointment containing 10 mg of Atropine Sulphate as completely as possible in 10 ml of petroleum spirit (boiling range, 40� to 60�) and extract with two 10-ml quantities of 0.05M sulphuric acid, washing each acid solution with the same 5 ml of petroleum spirit (boiling range, 40� to 60�). Mix the acid solutions, make alkaline with 5M ammonia and extract with two 15-ml quantities of chloroform. Evaporate the chloroform and dissolve the residue in 2 ml of ethanol (96%).Ergotamine injection (BP 2000)
Test Ergot alkaloids and related substances: Carry out the method for thin-layer chromatography.
For solution (1) add sufficient of a 10% w/v solution of sodium hydrogen carbonate to a volume of the injection containing 5.0 mg of Ergotamine Tartrate to make it distinctly alkaline to litmus paper. Extract with five 10-ml quantities of chloroform, filter the extracts through a small double filter paper, wash the filter with chloroform, evaporate the combined filtrates and washings to dryness at 20� at 2 kPa and dissolve the residue in 1 ml of a mixture of equal volumes of methanol and chloroform.Dispersible Aspirin Tablets (BP 2000)
Salicylic acid: To a quantity of the powdered tablets containing 0.50 g of Aspirin add 50 ml of chloroform, 2 ml of 2.5M sulphuric acid and shake vigorously for 2 minutes. Filter the chloroform extract through a dry filter paper containing 1 g of anhydrous sodium sulphate and evaporate 5 ml of the filtrate to dryness at room temperature using a rotary evaporator. Dissolve the residue in 2 ml of ethanol (96%), transfer to a Nessler cylinder with a further 1 ml of ethanol (96%), dilute to 50 ml with water at a temperature not exceeding 10�, add 1 ml of freshly prepared ammonium iron(III) sulphate solution R1, mix and allow to stand for 1 minute. Any violet colour produced is not more intense than that obtained by adding 1 ml of freshly prepared ammonium iron(III) sulphate solution R1 to a mixture of 3 ml of a freshly prepared 0.010% w/v solution of salicylic acid, 3 ml of ethanol (96%) and sufficient water to produce 50 ml contained in a second Nessler cylinder (0.6%).
Assay: Weigh and powder 20 tablets. Dissolve a quantity of the powder containing 0.3 g of Aspirin in 10 ml of 1M sulphuric acid and boil under a reflux condenser for 1 hour. Cool, transfer to a separating funnel, rinsing the flask and condenser with small quantities of water and extract the liberated salicylic acid with four 20-ml quantities of ether. Wash the combined ether extracts with two 5-ml quantities of water, evaporate the ether in a current of air at a temperature not exceeding 30�, dissolve the residue in 20 ml of 0.5M sodium hydroxide VS and dilute to 200 ml with water. Transfer 50 ml to a stoppered flask, add 50 ml of 0.05M bromine VS and 5 ml of hydrochloric acid, protect the solution from light, shake repeatedly during 15 minutes and allow to stand for 15 minutes. Add 20 ml of dilute potassium iodide solution, shake thoroughly and titrate with 0.1M sodium thiosulphate VS, using starch mucilage, added towards the end point, as indicator.Chlorpromazine Tablets (BP 2000)
IdentificationA. To a quantity of the powdered tablets containing 40 mg of Chlorpromazine Hydrochloride add 10 ml of water and 2 ml of 10m sodium hydroxide. Shake and extract with 15 ml of ether. Wash the ether layer with two 5-ml quantities of water, dry with anhydrous sodium sulphate and evaporate the ether. Dissolve the residue in 0.4 ml of chloroform. The infrared absorption spectrum of the resulting solution, Appendix II A, is concordant with the reference spectrum of chlorpromazine (RS 056).
Phenobarbital Elixir (BP 2000)Door achtereenvolgens vanuit zuur en daarna uit alkalisch milieu te extraheren kunnen uit een mengsel een zure en een basische stof van elkaar gescheiden worden zoals het onderstaande analysevoorschrift voor cotrimoxazoltabletten illustreert.
Definition: Phenobarbital Elixir is an oral solution containing 0.3% w/v of Phenobarbital in a suitable flavoured vehicle containing a sufficient volume of Ethanol (96 per cent) or of an appropriate Dilute Ethanol to give a final concentration of 38% v/v of ethanol.
Assay: Extract 50 ml with three 50-ml quantities of ether, wash the combined ether extracts with 20 ml of water, discard the washings, extract the ether solution with a mixture of 5 ml of 2M sodium hydroxide and 25 ml of water and then with two 5-ml quantities of water. Acidify the combined aqueous extracts to litmus paper with 2M hydrochloric acid, extract with four 25-ml quantities of ether, wash the combined ether extracts with two 2-ml quantities of water, wash the combined aqueous washings with 10 ml of ether, add the ether washings to the combined ether extracts, evaporate the ether and dry the residue of phenobarbital to constant weight at 105�.
Co-trimoxazole Tablets (BP 2000)Toevoeging van isopropanol of ethanol aan chloroform
Identification A. Filter the aqueous layer reserved in the Assay for trimethoprim. Add, dropwise, sufficient 2m hydrochloric acid to the filtrate to make it just acidic and extract with 50 ml of ether. Wash the ether layer with 10 ml of water, shake with 5 g of anhydrous sodium sulphate, filter and evaporate the filtrate to dryness using a rotary evaporator. Dissolve the residue in the minimum volume of a 5% w/v solution of sodium carbonate, add 1m hydrochloric acid dropwise until precipitation is complete and filter. Wash the residue sparingly with water and dry at 105�. The infrared absorption spectrum of the residue, Appendix II A, is concordant with the reference spectrum of sulfamethoxazole (RS 326).
B. To a quantity of the powdered tablets containing 50 mg of Trimethoprim add 30 ml of 0.1m sodium hydroxide and extract with two 50-ml quantities of chloroform. Wash the combined chloroform extracts with two 10-ml quantities of 0.1m sodium hydroxide and then with 10 ml of water. Shake with 5 g of anhydrous sodium sulphate, filter and evaporate to dryness using a rotary evaporator. The infrared absorption spectrum of the residue, Appendix II A, is concordant with the reference spectrum of trimethoprim (RS 354).
Door aan chloroform isopropanol of alcohol toe te voegen neemt de verdelingscoëfficiënt toe. Hiervan wordt gebruikt gemaakt bij de isolatie van morfine. Let er bij de voorbeelden van morfine op, dat hier vanwege de amfotere eigenschappen (pKa-waarden 8 en 10) in een ammonia/ammoniumbuffer bij pH 10 geëxtraheerd wordt.
Morphine Suppositories (BP 2000)Toevoegen van zouten aan aan de waterfase
Identification: Dissolve a quantity of the suppositories containing 90 mg of Morphine Hydrochloride or Morphine Sulphate in 25 ml of chloroform, extract with 50 ml of 0.01M hydrochloric acid and wash the aqueous layer with two 20-ml quantities of chloroform. Make the aqueous layer alkaline with ammonia buffer pH 10.0 and extract with two 40-ml quantities of a mixture of 3 volumes of chloroform and 1 volume of propan-2-ol. Dry the combined extracts with anhydrous sodium sulphate, filter and evaporate the filtrate to dryness. The infrared absorption spectrum of the residue, Appendix II A, is concordant with the reference spectrum of morphine (RS 237).Morphine tablets (BP 2000)
Assay: Weigh and powder 20 tablets. Shake a quantity of the powder containing 0.1 g of Morphine Sulphate with 25 ml of water and 5 ml of 1M sodium hydroxide, add 1 g of ammonium sulphate, shake to dissolve, add 20 ml of ethanol (96%) and extract with successive quantities of 40, 20, 20 and 20 ml of a mixture of 3 volumes of chloroform and 1 volume of ethanol (96%). Wash each extract with the same 5 ml of water, filter and evaporate the solvent. Dissolve the residue in 10 ml of 0.05M hydrochloric acid VS, boil, cool, add 15 ml of water and titrate the excess of acid with 0.05M sodium hydroxide VS using methyl red solution as indicator.Atenolol Oral Solution (BP 2000)
Identification: A. Carry out the method for thin-layer chromatography.
For solution (1), make a volume of the oral solution containing 50 mg of Atenolol alkaline with 1M sodium hydroxide (about 0.5 ml ), extract with three 10-ml quantities of a mixture of 1 volume of propan-2-ol and 3 volumes of chloroform, filter the combined extracts through anhydrous sodium sulphate, evaporate to dryness under reduced pressure with gentle heat and dissolve the residue in 0.5 ml of methanol.
Door zouten toe te voegen aan de waterfase kan de extractieopbrengst verhoogd worden.
Methadone Linctus (BP 2000)Extractie van ionen
Definition: Methadone Linctus is an oral solution containing 0.04% w/v of Methadone Hydrochloride in a suitable vehicle with a tolu flavour.
Identification: To 50 ml add 30 ml of water and add 1M sulphuric acid until the solution is acidic to litmus paper. Extract with two 20-ml quantities of petroleum spirit (boiling range, 40� to 60�), discarding the extracts, and add 5M sodium hydroxide until the solution is alkaline to litmus paper. Add 4 g of sodium chloride, shake to dissolve, extract with two 25-ml quantities of ether and wash the combined ether extracts with five 20-ml quantities of water. Dry with anhydrous sodium sulphate, filter, evaporate to dryness and dry the residue over phosphorus pentoxide at a pressure of 2 kPa. The residue complies with the following tests....Dexamfetamine Tablets (BP 2000)
Assay: Weigh and powder 20 tablets, or more if necessary. Dissolve a quantity of the powder containing 0.1 g of Dexamfetamine Sulphate as completely as possible in 20 ml of water, add 8 g of sodium chloride and 2 ml of 5m sodium hydroxide and extract with successive quantities of 50, 20, 20 and 20 ml of ether. Extract the combined ether extracts with four 10-ml quantities of 0.1m hydrochloric acid and make the combined acid extracts alkaline with 5m sodium hydroxide. Dilute to 120 ml with water and distil into 20 ml of 0.05m hydrochloric acid VS until only 5 ml of liquid remains in the distillation flask. Boil, cool and titrate the excess of acid with 0.05m sodium hydroxide VS using methyl red solution as indicator.Betamethasone Injection (BP 2000)
Definition: Betamethasone Injection is a sterile solution of Betamethasone Sodium Phosphate in Water for Injections.
Assay: Dilute a volume containing the equivalent of 20 mg of betamethasone with sufficient water to produce 200 ml. To 25 ml add 2.5 g of sodium chloride, dissolve, add 1 ml of hydrochloric acid and shake with three 25-ml quantities of chloroform. Wash each chloroform layer with 1 ml of 0.1m hydrochloric acid, add the washings to the aqueous solution and discard the chloroform solutions. Extract the aqueous solution with two 10-ml quantities of tributyl orthophosphate and dilute the combined extracts to 25 ml with methanol. To 2 ml add 10 ml of isoniazid solution, heat in a stoppered tube at 50� for 3 hours, protecting the solution from light, cool and measure the absorbance of the resulting solution at the maximum at 405 nm,
Als regel worden geladen verbindingen niet geëxtraheerd. Hierop zijn echter een aantal uitzonderingen: Sterk lipofiele basen kunnen soms in de vorm van hun hydrochloride vanuit zoutzuur milieu als ionpaar met chloroform geextraheerd worden zoals onderstaande voorbeelden van dicycloverine en diphenhydramine illustreren. Let bij deze voorschriften op de voorzuivering door een extractie met ether.
Dicycloverine Oral solution (BP 2000)De quaternaire ammoniumverbindingen benzalkoniumchloride, benzethoniumchloride, cetrimide, cetylpyridiniumchloride en domiphenbromide worden voor de kwantitatieve bepaling als ionpaar met jodide geëxtraheerd. De overmaat jodide wordt vervolgens titrimetrisch bepaald met natriumjodaat. Let er bij deze extracties op, dat zij in sterk alkalisch milieu worden uitgevoerd om de storing door andere (niet quaternaire) aminen te voorkomen.
Identification: A. To a volume containing 0.1 g of Dicycloverine Hydrochloride add 10 ml of water and 1 ml of hydrochloric acid, shake with 30 ml of ether and allow to separate. Extract the aqueous layer with 30 ml of chloroform, wash the extract with two 10-ml quantities of water and filter the chloroform solution through anhydrous sodium sulphate. Evaporate the filtrate to dryness, recrystallise the residue from hot acetone and dry the precipitate at 105� for 30 minutes. The infrared absorption spectrum of the residue, Appendix II A, is concordant with the reference spectrum of dicycloverine hydrochloride (RS 098).Diphenhydramine Oral Solution (BP 2000)
Identification A. Carry out the method for thin-layer chromatography. For solution (1) acidify a quantity of the oral solution containing 50 mg of Diphenhydramine Hydrochloride with 2M hydrochloric acid, shake with three 20-ml quantities of ether, discard the ether, extract with two 20-ml quantities of chloroform, dry the combined extracts over anhydrous sodium sulphate, filter, evaporate the chloroform and dissolve the cooled residue in 5 ml of chloroform.
Benzalkonium Chloride (BP 2000)Door een ion in combinatie met een gekleurd ion van tegengestelde lading te extraheren kunnen gekleurde ionparen verkregen worden waarvan de concentratie via de lichtabsorptie bepaald kan worden.
ASSAY: Dissolve 2.00 g in water R and dilute to 100.0 ml with the same solvent. Transfer 25.0 ml of the solution to a separating funnel, add 25 ml of chloroform R, 10 ml of 0.1M sodium hydroxide and 10.0 ml of a freshly prepared 50 g/l solution of potassium iodide R. Shake well, allow to separate and discard the chloroform layer. Shake the aqueous layer with three quantities, each of 10 ml, of chloroform R and discard the chloroform layers. To the aqueous layer add 40 ml of hydrochloric acid R, allow to cool and titrate with 0.05M potassium iodate until the deep-brown colour is almost discharged. Add 2 ml of chloroform R and continue the titration, shaking vigorously, until the chloroform layer no longer changes colour. Carry out a blank titration on a mixture of 10.0 ml of the freshly prepared 50 g/l solution of potassium iodide R, 20 ml of water R and 40 ml of hydrochloric acid R.
Clonidine Injection (Bp 2000)
Assay: To a volume containing 0.15 mg of Clonidine Hydrochloride add 25 ml of citro-phosphate buffer pH 7.6. Add 5 ml of water and 1 ml of a solution containing 0.15% w/v of bromothymol blue and 0.15% w/v of anhydrous sodium carbonate. Add 30 ml of chloroform, shake for 1 minute and centrifuge. To 15 ml of the chloroform layer add 10 ml of boric acid solution and measure the absorbance of the resulting solution at the maximum at 420 nm.Methadone Linctus(BP 2000)
Assay: To 30 g add 1 ml of glacial acetic acid and dilute to 100 ml with water. To 10 ml of the resulting solution add 10 ml of a 0.4% w/v solution of picric acid and 10 ml of phosphate buffer pH 4.9, extract with three 15-ml quantities of chloroform and dilute the combined chloroform extracts to 50 ml with chloroform. To 10 ml add sufficient chloroform to produce 20 ml and measure the absorbance of the resulting solution.Docusate Tablets (BP 2000)
Assay: Weigh and powder 20 tablets. To a quantity of the powder containing 50 mg of Docusate Sodium add 8 ml of propan-2-ol, mix with the aid of ultrasound for 5 minutes and add sufficient propan-2-ol to produce 10 ml. Centrifuge and dilute 5 ml of the supernatant liquid to 250 ml with water. To 4 ml add 20 ml of a 1.6% w/v solution of sodium sulphate in 0.1M sulphuric acid and 4 ml of basic fuchsin solution. Mix and extract immediately with four 20-ml quantities of chloroform, filtering each extract successively through absorbent cotton moistened with chloroform. Wash the cotton with chloroform and dilute the combined washings and extracts to 100 ml with chloroform. Measure the absorbance of the resulting solution at the maximum at 557 nm.
Als regel worden anorganische zouten niet geëxtraheerd. Ook hierop bestaan echter een aantal belangrijke uitzonderingen, zoals de extractie van zware metalen als complex met dithizon.
Phenylmercuric Nitrate (BP 2000)
Identification: C. To 5 ml of solution S add 1 ml of dilute hydrochloric acid R, 2 ml of methylene chloride R and 0.2 ml of dithizone solution R. Shake. The lower layer is orange-yellow.
In aantal monografieën van grondstoffen wordt ijzer vooafgaande aan de reactie op zware metalen vanuit zoutzuur milieu met methylisobutylketon geëxtraheerd.
Ferrous Gluconate (PB 2000)
Heavy metals (2.4.8). Thoroughly mix 2.5 g with 0.5 g of magnesium oxide R1 in a silica crucible. Ignite to dull redness until a homogeneous mass is obtained. Heat at 800�C for about 1 h, allow to cool and take up the residue in 20 ml of hot hydrochloric acid R. Allow to cool. Transfer the liquid to a separating funnel and shake for 3 min with three quantities, each of 20 ml, of methyl isobutyl ketone saturated with hydrochloric acid (prepared by shaking 100 ml of freshly distilled methyl isobutyl ketone R with 1 ml of hydrochloric acid R). Allow to stand, separate the aqueous layer, reduce to half its volume by boiling, allow to cool and dilute to 25 ml with water R. Neutralise 7.5 ml of this solution to red litmus paper R using dilute ammonia R1 and dilute to 15 ml with water R. 12 ml of the solution complies with limit test A for heavy metals (20 ppm). Prepare the standard using lead standard solution (1 ppm Pb) R.
Technische uitvoering van extracties
Hanteren van scheitrechters
Extracties worden over het algemeen uitgevoerd in scheitrechters.
Bij het hanteren hiervan moet op een aantal punten letten:
- Voorzichtig schudden: Vermijd te intensief schudden. Hierbij kunnen emulsies ontstaan die zeer langzaam ontmengen. Uitschudden geschiedt meer door intensief omzwenken dan door intensief schudden.
- Ontluchten: Wanneer met vluchtige extractiemiddelen zoals diethylether geëxtraheerd wordt, ontstaat door verdamping van de ether een overdruk in de scheitrechter. het is dan nodig tussentijds te ontluchten. Dit ontluchten geschiedt via de stop aan de bovenzijde en niet door de scheitrechter ondersteboven te houden en de kraan van de onderzijde te openen.
- Verzamelen van de lagen: Nadat de lagen ontmengd zijn wordt de onderste laag aan de onderzijde afgetapt. Vervolgens wordt de bovenste laag aan de bovenzijde uitgeschonken.
- Meervoudige extractie: Vaak is het nodig de waterlaag meermalen te extraheren om een voldoend volledige extractie te bereiken. Hierbij dient men er rekening mee te houden dat drie maal extraheren met 10 ml chloroform een beter resultaat oplevert dan één maal extraheren met 30 ml chloroform.
- Controleren van de volledigheid van de extractie: Het is aan te bevelen om na de laatste extractie met het organisch oplosmiddel de volledigheid van de extractie te controleren door de waterlaag nogmaals te extraheren. Het aldus verkregen extract wordt apart gehouden en onderzocht op de aanwezigheid van de te analyseren stof.
Bij de keuze van het extractiemiddel laat men zich in de praktijk vaak mede leiden door de dichtheid van het extractiemiddel. Bij meervoudige extractie is het werken met chloroform, e zwaarder dan water, minder omslachtig is dan met extractiemiddelen die lichter dan water zijn. Bij extractie met chloroform blijft de waterlaag na het aftappen van de extracten in de scheitrechter achter. Het is daardoor niet nodig voor ieder extractiestap een nieuwe scheitrechter te gebruiken. Bij meervoudige extractie met ether moet de waterlaag steeds in een nieuwe scheitrechter overgebracht worden.
Wassen en drogen van de verkregen extracten
Omdat het in de praktijk niet mogelijk is bij een extractie een volledige fasenscheiding te verkrijgen is het noodzakelijk de verkregen extracten met een kleine hoeveelheid water te schudden (te wassen). Hierbij worden de spoortjes van de oorspronkelijke waterfase, die nog in het extract aanwezig waren verwijderd.
Wanneer ether met water geschud wordt (bij 20o) lost in het water 6,3% ether op, terwijl in de ether 1,2% water oplost. Voor chloroform (bij 15o) zijn deze hoeveelheden respectievelijk 0,5% en 0,1%.
Het in de extracten aanwezige water stoort soms bij het vervolg van de analyse (bij voorbeeld bij het opnemen van een IR-spectrum). Om deze reden is het wenselijk de verkregen extracten te drogen. Etherextracten bevatten veel water en worden gedroogd door er een voldoend grote hoeveelheid uitgedroogd natriumsulfaat aan toe te voegen. Chloroformextracten, die veel minder water bevatten worden gedroogd met een kleinere hoeveelheid uitgedroogd natriumsulfaat of door filtratie door een droog papieren filter of een propje watten.
Milieueffecten van chloroform en gehalogeneerde koolwaterstoffen
De hoeveelheid gehalogeneerde koolwaterstoffen die in het afvalwater toegestaan zijn zeer zeer laag. Om te voorkomen, dat deze normen overschreden worden dient het gebruiker van zo veel mogelijk beperkt te worden.
Verdelingscoëfficiënten zoeken
Er bestaan geen tabellen waarin de analytisch relevante verdelingscoëfficiënten kunnen worden opgezocht. Men kan echter wel op aan aantal manieren bruikbare indicties voor het gedrag van de stoffen in extractiesystemen vinden.
1. Voor veel stoffen vindt men in de monografieën van de BP of de USP beschrijvingen van extracties.
2. Men kan een indruk van de verdelingscoëfficiënten krijgen door de oplosbaarheden in de verschillende oplosmiddelen te vergelijken. Als voorbeeld worden hieronder de oplosbaarheden van naproxen volgens de Ph. Eur. (1997: 0731) vermeld:
practically insoluble in water (1 g in more than 10 000 g),Uit deze gegevens volgt dat de verhouding van de oplosbaarheid in ether en die water groter is dan 100. Dat betekent dat men voor naproxen in het systeem ether/water rekenen met een verdelingscoëffiënt die groter is van 100.
soluble in alcohol and in methanol ( 1g in 10 to 30 g),
sparingly soluble in ether. ( 1g in 30 to 100g)
Wel of geen Clean Up toepassen
Bij de analyse van bereidingen worden klassieke kleurreacties in toenemende mate vervangen door chromatografische en spectrometrische methoden. Chromatografische methoden zijn in wezen scheidingsmethoden gevolgd worden door een detectie methode.
De chromatografische methode levert vrijwel altijd een effectievere scheiding op dan de meeste hiervoor behandelde clean-up methoden. Bij de toepassing van chromatografische methoden kan daardoor in veel gevallen afgezien worden van een voorafgaande clean-up procedure.
Het te chromatograferen monster moet echter wel aan twee eigenschappen voldoen:
11 juni 2001